CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的有效運(yùn)行依賴(lài)于Cas9酶在特定目標(biāo)位點(diǎn)切割DNA。但是，這一技術(shù)卻面臨著“脫靶”的風(fēng)險(xiǎn)，即Cas9酶可能會(huì)在錯(cuò)誤的位置剪切。我們都知道，編輯了“預(yù)想之外”的基因，很有可能會(huì)帶來(lái)不可預(yù)控的嚴(yán)重后果。
通常，我們檢測(cè)非靶標(biāo)突變（off-target mutations）的方法是：先利用計(jì)算機(jī)算法預(yù)測(cè)出最可能被“錯(cuò)誤擊中”的區(qū)域，然后再檢查這些“危險(xiǎn)區(qū)域”的缺失和插入情況。
9月12日，《Nature》期刊最新發(fā)表一篇題為“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”的研究，揭示了一種預(yù)測(cè)基因組編輯中“錯(cuò)誤突變”的新策略，并在小鼠試驗(yàn)中證實(shí)精心設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA鏈不會(huì)產(chǎn)生任何可檢測(cè)到的錯(cuò)誤突變。
“脫靶效應(yīng)”有多嚴(yán)重
非靶向剪切可能發(fā)生在對(duì)生物功能沒(méi)有影響的基因組位置，也可能會(huì)破壞細(xì)胞的基本功能。通常，研究人員會(huì)利用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行預(yù)測(cè)，但是這些預(yù)測(cè)依賴(lài)于引導(dǎo)RNA如何與DNA結(jié)合以及Cas9如何切割的假設(shè)。
2017年5月，《Nature Methods》期刊曾發(fā)表一篇文章，揭示CRISPR能夠引入數(shù)百種意想不到的突變。他們發(fā)現(xiàn)，CRISPR確實(shí)能夠成功糾正引發(fā)失明的基因，但兩只接受了基因治療的小鼠的基因組中存在超過(guò)1500個(gè)單核苷酸突變以及超過(guò)100處更大片段的缺失和插入。需要強(qiáng)調(diào)的是，這些DNA突變都沒(méi)有被計(jì)算機(jī)算法預(yù)測(cè)出來(lái)。
雖然錯(cuò)誤概率遠(yuǎn)超我們的認(rèn)知，但是我們依然缺乏一種能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)CRISPR非靶標(biāo)編輯的方法，這意味著，目前我們還不清楚這些預(yù)測(cè)突變是否會(huì)發(fā)生以及發(fā)生的頻率如何。
最新研究：引導(dǎo)RNA 是關(guān)鍵
文章作者、瑞典阿斯利康公司的生物學(xué)家Marcello Maresca表示，公司的一個(gè)長(zhǎng)期目標(biāo)是能夠使用基因編輯技術(shù)治療一些人類(lèi)疾病。“然而，要想實(shí)現(xiàn)CRISPR藥物的潛力，就需要開(kāi)發(fā)出一種方法，能夠讓目標(biāo)基因得到有效修飾，且基因組其他位置不受影響。”
在這項(xiàng)新研究中，Maresca團(tuán)隊(duì)與哈佛大學(xué)和麻省總醫(yī)院的生物學(xué)家、病理學(xué)家J. Keith Joung課題組合作，開(kāi)發(fā)了一種“體內(nèi)非靶點(diǎn)驗(yàn)證”的方法（verification of in vivo off-targets，VIVO），可以穩(wěn)定地鑒定出CRISPR在體內(nèi)全基因組中的脫靶效應(yīng)。
首先，他們以小鼠基因組為研究對(duì)象，在體外將其DNA剪切成片段，每個(gè)片段約包含300個(gè)堿基對(duì)，然后連接一系列使DNA形成閉環(huán)的“接口”（adapters）。隨后，他們引入一個(gè)Cas9核酸酶和引導(dǎo)RNA復(fù)合體，它們會(huì)在環(huán)狀DNA的一些位點(diǎn)上進(jìn)行切割，使其線性化。最后，研究人員會(huì)添加另一批核酸酶，負(fù)責(zé)降解剩余未被剪切的閉環(huán)DNA。
通過(guò)這一系列步驟，研究人員可以對(duì)線性化的DNA進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)Cas9在哪些位置進(jìn)行了切割（無(wú)論是有意的還是無(wú)意的），同時(shí)預(yù)測(cè)引導(dǎo)RNA是否會(huì)在體內(nèi)引發(fā)脫靶效應(yīng)。
以上體外驗(yàn)證工作是J. Keith Joung團(tuán)隊(duì)于2017年完成的工作（發(fā)表在《Nature Methods》期刊）?，F(xiàn)在，他們將成果轉(zhuǎn)移至體內(nèi)：利用一引導(dǎo)RNA（在體外預(yù)測(cè)中，發(fā)現(xiàn)其會(huì)在基因組中造成數(shù)千個(gè)錯(cuò)誤剪切位點(diǎn)）進(jìn)行小鼠體內(nèi)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，超40%的預(yù)測(cè)位點(diǎn)在小鼠肝 臟中確實(shí)發(fā)生了突變。
而且，在體外預(yù)測(cè)中，一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率越高，它在體內(nèi)發(fā)生突變的可能性就越大。換句話說(shuō)，引導(dǎo)RNA在體外是“粗心”的，在體內(nèi)肯定也是粗心的。
研究團(tuán)隊(duì)還檢測(cè)了小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中基因組上的特殊位點(diǎn)——這些點(diǎn)在計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)中都屬于可能的脫靶位點(diǎn)，但是在體外試驗(yàn)中并沒(méi)有出現(xiàn)——結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)試驗(yàn)中這些位點(diǎn)并沒(méi)有出現(xiàn)突變。這意味著，體外試驗(yàn)并沒(méi)有錯(cuò)過(guò)真正的非目標(biāo)剪切。
更重要的是，他們證實(shí)，設(shè)計(jì)對(duì)靶點(diǎn)高度特異性的引導(dǎo)RNA，可以有效指導(dǎo)小鼠肝 臟細(xì)胞的基因編輯，且不會(huì)出現(xiàn)可檢測(cè)到的非靶向突變。
這項(xiàng)研究證實(shí)“你確保有一個(gè)真正準(zhǔn)確的引導(dǎo)RNA”，多倫多大學(xué)的發(fā)育生物學(xué)家Janet Rossant表示，“這項(xiàng)研究的突破性在于，VIVO能夠檢測(cè)出細(xì)胞特定的非靶標(biāo)突變，而不是依賴(lài)于參考基因組序列（不一定能夠反映你所研究的有機(jī)體的遺傳背景，或者在臨床應(yīng)用中患者的遺傳背景）。由于可以針對(duì)來(lái)自于患者或者特定有機(jī)體的基因組DNA在體外進(jìn)行篩選，因此測(cè)序步驟的讀取結(jié)果反映了受試者基因組中可能的Cas9目標(biāo)。”
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