冷泉港實驗室的研究人員在研究一種乳腺癌細胞時，發(fā)現(xiàn)一個奇怪現(xiàn)象。之前的研究顯示這種癌細胞的增殖是由于一種 MELK 的蛋白過度表達引起的，但研究人員在使用 CRISPR 基因編輯技術敲除了編碼該蛋白的基因后，癌細胞的生長居然沒有受到任何影響。
更不可思議的是，之前認為靶向 MELK 的藥物依然能很好地抑制 MELK 敲除的癌細胞生長，哪怕藥物應該針對的靶點已經(jīng)不存在了。
研究人員覺得應該看看別的靶點是否也存在這個問題。由此，他們開展了一項系統(tǒng)研究，并在最近宣告解開了一批癌癥藥物研發(fā)失敗的謎底：一種用來降低蛋白表達的實驗方法的高脫靶率，在很大程度上影響了科學家對抗癌靶點的判斷。
這一研究發(fā)表了9月12日上線的《科學-轉(zhuǎn)化醫(yī)學》（Science Translational Medicine）雜志。
01
什么是藥物靶點？
這里，需要先解釋一下靶點的概念。靶點是我們理解本研究的關鍵。
早期的癌癥藥物多數(shù)為細胞**藥物，尤其是影響細胞分裂的藥物。它們抗癌的原理是癌細胞通常具有比正常細胞更快的分裂速度，因此這些藥物對癌細胞的**更大。但這類藥物對正常細胞**也很大，副作用非常明顯。
隨著研究的深入，人們逐漸理解到不同的癌癥是由不同的基因突變所導致，其不正常的生物學特性也是由于不同的細胞通路被異常激活或抑制。通過設計小分子藥物來特異性地影響這些通路中關鍵的蛋白（通常是酶），可以精準地殺死或抑制癌細胞，把藥物對正常細胞的影響大大降低。這就是通常所說的靶向藥物，它們所針對的關鍵蛋白被稱為藥物靶點。
靶向藥物大大增加了人類對抗癌癥的武器庫，《我不是藥神》電影中治療慢性髓細胞白血病的藥物原型格列衛(wèi)就是一種抑制酪氨酸激酶靶點的靶向藥。
好了，接下來可以進入我們要介紹的論文了。
02
建在“不可靠”基礎上的藥物研發(fā)？
冷泉港的研究人員選取了10種不同的靶向藥物。這些藥物都在之前的研究中被認為抑制了特定腫瘤靶點，而且都有報道這些靶點被抑制后足以阻礙癌細胞的生長。
這10種藥物中，有7種已經(jīng)進入臨床試驗，而另外3種也進入臨床前開發(fā)階段。這些藥物針對的靶點包括 CASP3，HDAC6， MAPK14，PAK4，PBK 以及 PIM1。
為了驗證這些靶點確實影響癌細胞生長，研究人員在這些靶點起作用的細胞系中使用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術敲除了相應靶點的基因。然而就像 MELK 一樣，所有這些靶點敲除了以后，癌細胞的生長都沒受到顯著的影響。
即使所有測試的靶點都恰好碰到不起作用的細胞系可能性很小，研究人員還是擴大了測試范圍。例如，HDAC6 被報道對于 ARID1A 突變的卵巢癌細胞生長是必須的，研究人員在4種不同的 ARID1A 突變卵巢癌細胞（A2780，OVK18，OVTOKO，和TOV-21G）中敲除了 HDAC6，但卵巢癌細胞的生長沒有受到任何影響。
類似地，PIM1 被報道在三陰乳腺癌中其重要作用，而研究人員在7種三陰乳腺癌細胞中敲除了 PIM1，都沒有發(fā)現(xiàn)顯著影響。而作為對照，已有成功藥物上市的靶點，如 MEK1，在A375黑色素瘤細胞系中敲除則顯著影響了細胞的生長，證明了研究方法的可靠性。
這么多的癌癥靶點敲除后都沒有影響，研究人員意識到，篩選靶點的范圍可以擴大。
接下來，他們在485種不同的癌細胞中進行了 CRISPR 的全基因組范圍大規(guī)模篩選，結果和之前的數(shù)據(jù)吻合。一些已知的重要靶點，如 AuroraB，BRAF 和 PIK3A 等，總是可以在相應的細胞系中被篩選到。而之前細胞系測試中不起作用的幾個靶點，在大規(guī)模篩選中也同樣不起作用。
很多靶點除了本身的抑癌功能，還能與別的抗癌藥物協(xié)同作用。例如，HDAC6 能夠?qū)ξ⒐艿鞍兹ヒ阴；?，抑制該酶使癌細胞對靶向微管的藥物更加敏感。而目前有兩個臨床試驗正在測試 HDAC6 抑制劑與紫杉醇（一種常用的抗癌藥，作用機制為干擾細胞分裂時微管的正常功能）聯(lián)合使用的效果。研究人員測試了 HDAC6敲除的癌細胞系，發(fā)現(xiàn) HDAC6 的缺失并不能使細胞對紫杉醇以及其它4種抗癌藥物更敏感。作者測試了其它目前在臨床試驗的靶點，如 MAPK14，得到的結果也類似。這些實驗說明，很多通過增強別的抗癌藥，從而 “曲線救國” 的可能性也被否定了。
這些結果無疑說明，之前的很多抗癌靶點研究結論是不可靠的。而建立在不可靠基礎上的藥物開發(fā)，失敗率居高不下也可以理解了。
03
RNAi實驗是罪魁禍首？
如果說某一項研究的結論不可靠，偶然因素可能性比較大。但是如果同類型的研究不可靠性比例都很高，則可能是實驗方法的系統(tǒng)性問題。
研究人員仔細分析了這類之前研究篩選有效，但敲除后相應靶蛋白卻沒有影響的靶點，發(fā)現(xiàn)它們之前的結論都來自于RNAi實驗。
RNAi 是一種用小分子 RNA 來降低蛋白表達的實驗方法，相比基因敲除，這種方法實驗簡單且成本較低，在 CRISPR 系統(tǒng)成熟之前，是大規(guī)?；蚪M篩選的主流方法。雖然有很多優(yōu)點，但這種方法有個很大的缺陷，即脫靶效應比較嚴重。同一個小分子 RNA 在細胞里，可能同時抑制多種和其序列相似的基因表達。
為了驗證 RNAi 是否有很高比例造成靶點誤讀，研究人員選取了一些之前研究中發(fā)現(xiàn)的靶點，并使用相同的 RNAi 分子重復了前人的實驗。
例如，以前的報告發(fā)現(xiàn)，PAK4 的 RNAi 分子在 HCT116 結腸癌細胞中抑制癌細胞生長，PIM1 在 MDA-MB-231 乳腺癌細胞中抑制腫瘤細胞生長。經(jīng)過驗證，這些 RNA 分子確實能抑制癌細胞生長。但是，經(jīng)過靶點的 CRISPR 敲除，研究人員發(fā)現(xiàn)，這些RNAi靶點敲除的細胞, 和沒有敲除的細胞一樣，生長被相應 RNAi 分子所抑制。這確證無誤地表明，RNAi 實驗的高脫靶率，在很大程度上影響了科學家對抗癌靶點的判斷。
最后，研究人員選取了一種目前正在臨床前研發(fā)階段的藥物 OTS964，做進一步的研究。該藥物在針對 PBK（TOPK）靶點的篩選中被發(fā)現(xiàn)。同樣，在使用 CRISPR 敲除 PBK 的癌細胞中，該藥物依然能很好地抑制癌細胞生長。這說明這個化合物還有其它靶點。
通過高濃度 OTS964 誘導癌細胞發(fā)生耐藥突變，研究人員使用全外顯子組測序發(fā)現(xiàn) OTS964 的真正靶點不是之前認為的 PBK，而是一種細胞周期激酶 CDK11。同時，研究者發(fā)現(xiàn)很多癌細胞的增殖都依賴于 CDK11,這也解釋了 OTS964 能夠在 PBK 敲除的癌細胞中對癌細胞產(chǎn)生抑制。
研究的通訊作者 Jason Sheltzer 博士在冷泉港新聞發(fā)布會上表示： “很多抗癌藥物在人體試驗時很不幸地不起作用。如果在這些藥物進入臨床試驗前，常規(guī)地獲取和我們的實驗類似的證據(jù)，我們可能能夠更好地將病人分配到最可能收益的試驗中。有了這些知識，我相信我們能更好地踐行精準醫(yī)學的承諾。”
04
時間會給出答案
但也有學者對這項研究提出了不同的意見。美國埃默里大學醫(yī)學院人類遺傳學系教授金鵬認為，作者過度解讀了他們的結果。 “ RNAi 實驗可能是第一個用來發(fā)現(xiàn)這些藥物靶點的技術，但肯定不是最后用來決定藥物走向臨床試驗的技術。任何臨床實驗都需要大量的前期實驗才能被FDA批準，只靠RNAi 實驗是不可能的。這里肯定有其他因素，不是RNAi 的結果就能全部解釋的。”
金鵬同時指出，癌細胞基因組出了名的不穩(wěn)定，因此作者使用的細胞系可能有一些問題。 “這項研究所有的結論都來自體外細胞實驗（in vitro），他們應該用活體細胞（ex vivo）來驗證他們不同尋常的結論。”
“另外，作者認為 CRISPR 技術可以產(chǎn)生背景更干凈，更好的敲除細胞系。但CRISPR 也存在脫靶和其它我們目前還未知的問題。就像 RNAi 一樣，隨著時間的推移，人們也逐漸意識到 RNAi 不同的問題，但至少它還是一個不錯的實驗系統(tǒng)。”
“時間會給出答案。” 金鵬說。
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