工藝設(shè)備中生物膜的形成會導(dǎo)致后續(xù)GMP生產(chǎn)中的一系列問題。工藝設(shè)備表面由革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌和細(xì)菌孢子等組成的生物膜會影響到使用此設(shè)備生產(chǎn)的產(chǎn)品的安全性、成分、規(guī)格、質(zhì)量和純度，并可能進(jìn)一步導(dǎo)致產(chǎn)品污染、危害消費(fèi)者從而受到法規(guī)懲罰。

       FDA關(guān)于微生物污染的法規(guī)如下：

       對于非無菌藥品生產(chǎn)，需要設(shè)立并遵守適當(dāng)?shù)臅娌僮髁鞒桃灶A(yù)防有害微生物污染。

       對于無菌藥品生產(chǎn)，需要設(shè)立并遵守適當(dāng)?shù)臅娌僮髁鞒桃灶A(yù)防有害微生物污染。此類操作流程需要包括所有無菌和滅菌工藝的驗(yàn)證。

       如下文中的例子，產(chǎn)品的微生物污染通常會導(dǎo)致召回。

       這家公司聲稱其在2017年8月1日至2018年4月生產(chǎn)的產(chǎn)品中，有一"小部分"微生物污染檢測結(jié)果為陽性。2018年7月，這家公司宣布因?yàn)樵贔DA例行檢查中發(fā)現(xiàn)有布氏假單胞菌、熒光假單胞菌和多噬伯克霍爾德氏菌污染召回4個(gè)批次的產(chǎn)品。

       FDA法規(guī)和上述產(chǎn)品召回的案例證明微生物污染對于藥品生產(chǎn)者和監(jiān)管者而言都是明確的關(guān)注點(diǎn)。任何在生產(chǎn)現(xiàn)場發(fā)生的微生物污染問題都需要用適當(dāng)和徹底的調(diào)查以及強(qiáng)有力的糾正和預(yù)防措施來處理。

       本文將會闡述生物膜的生命周期、可能會引起生物膜形成的條件或因素以及生物膜問題處理的方法。這些內(nèi)容可以幫助藥品生產(chǎn)者前攝性地采取適當(dāng)?shù)牟僮髁鞒桃员M可能減少生物膜污染的風(fēng)險(xiǎn)。

       生物膜的生命周期

       微生物一般是浮游性的，例如在培養(yǎng)基中根據(jù)代謝和生產(chǎn)特性處于未貼壁或自由懸浮狀態(tài)。最近的研究發(fā)現(xiàn)微生物也可以在材料表面附著、生長，形成復(fù)雜的微生物群落。這一現(xiàn)象引發(fā)了后續(xù)關(guān)于表面附著微生物（生物膜）性質(zhì)的研究。

       生物膜到底是什么？一般認(rèn)為，生物膜是由多種微生物組成的生物群落，其外包被有黏滑的、由多糖、核酸和蛋白組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的"胞外多聚物基質(zhì)"。

       以下是生物膜生命周期的三個(gè)主要階段：

       Diagram 1: Biofilm Lifecycle

       第一階段：附著

       自由浮動的或浮游的細(xì)菌細(xì)胞在潮濕環(huán)境下可以附著在材料表面并開始分泌被稱為胞外多聚物基質(zhì)（EPS）的黏滑、膠狀基質(zhì)。附著在表面的微生物可以是單一種屬，也可以由多種細(xì)菌、真菌、藻類、酵母、原生動物或其他微生物以及細(xì)胞碎片和腐蝕產(chǎn)物組成。

       第二階段：生長

       在胞外多聚物基質(zhì)的保護(hù)下，生物膜可以快速成長為具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的群落，視環(huán)境條件從若干層細(xì)胞到幾英寸厚不等。

       第三階段：脫落

       生物膜生長成熟后，大小不等的細(xì)胞團(tuán)塊和碎片可以從其三維結(jié)構(gòu)上脫離，使得原群落中的細(xì)菌可以散播并附著到下游的其他表面或生物膜群落上。

       生物膜污染經(jīng)常反復(fù)發(fā)生。短時(shí)間內(nèi)污染問題可能表現(xiàn)為受控狀態(tài)。但是如果針對生物膜的去除和處理措施不夠有效，一段時(shí)間后仍然可能發(fā)現(xiàn)污染。

       形成生物膜的影響因素

       下文的表2列舉了一些工藝設(shè)備中可能會導(dǎo)致生物膜形成的因素。

       設(shè)備/工藝：管道中流速小于1.5 m/s會增加微生物附著在管道表面的可能性。死角是指工藝設(shè)備中一些液體容易潴留且不易和清洗劑和水充分交換的部位。長徑比（L/D）大于1.5的死角易形成潴留液體、積累殘留或微生物。非衛(wèi)生級閥門易積累殘留且不易清洗，通常建議使用衛(wèi)生級閥門如隔膜閥或夾管閥。管路的不適當(dāng)坡度會影響排水能力，從而增加液體潴留在系統(tǒng)中的可能。通常建議的管路坡度為0.5% - 1%（每1米下降0.5到1厘米）以保證排水能力。

       表面粗糙度：通常用Ra，即輪廓算數(shù)平均偏差來衡量某一材料的表面粗糙度。不銹鋼表面的腐蝕會增加其表面粗糙度。在此情況下，其表面會更不容易清洗。因此常規(guī)的清洗操作流程有可能不能有效去除粗糙表面的殘留。而這些產(chǎn)品殘留會給生物膜的生長提供良好的條件。

       殘留：開發(fā)清洗工藝（包括使用合適的清洗試劑、時(shí)間、清洗劑濃度和溫度）時(shí)需要考慮的重要因素。開發(fā)出來的清潔工藝必須證明能夠持續(xù)有效地去除產(chǎn)品殘留。產(chǎn)品殘留除了會影響殺菌或滅菌工藝的有效性，同時(shí)也為微生物生長提供了營養(yǎng)源。

       Diagram 2: Factors leading to Biofilm Formation

       生物膜問題處理

       工藝設(shè)備中生物膜問題存在的最初信號之一是微生物檢測中頻繁發(fā)生微生物超標(biāo)。胞外多聚物基質(zhì)（EPS）保護(hù)了生物膜中的微生物并增加了其對于殺菌和清洗工藝的抵抗能力。如果一家工廠遭遇了反復(fù)發(fā)生的微生物污染事件，其首要任務(wù)是確定和徹底清除微生物污染的來源。關(guān)于生物膜問題經(jīng)常問到的問題是："如何徹底清除生物膜？"

       一旦在系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)有可能的生物膜問題，需要采取生物膜處理措施以去除生物膜殘留并同時(shí)對整個(gè)設(shè)備進(jìn)行滅菌。這類處理措施通常可以分為三步。

       使用堿性配方清洗劑以穿透EPS并使EPS失活。配方清洗劑中的表面活性劑能夠有效地穿透EPS并使EPS失活。去除EPS保護(hù)層對徹底清除生物膜非常重要。

       不銹鋼表面的腐蝕或紅銹經(jīng)常伴隨生物膜問題一同存在。在這種情況下，需要對腐蝕/銹蝕表面進(jìn)行除銹和鈍化以修復(fù)不銹鋼表面的鈍化膜。如果沒有發(fā)現(xiàn)紅銹問題則可以省略這一步。

       使用殺孢子劑或高溫蒸汽對整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行滅菌

       這一步通過使用殺孢子劑（例如過氧化氫/過乙酸混合物、異丙醇、乙醇或高溫蒸汽滅菌）徹底清除工藝系統(tǒng)中殘存的微生物。

       美國環(huán)保署（EPA）有兩種標(biāo)準(zhǔn)測試方法來評估消毒試劑對于兩種易形成生物膜的微生物（綠膿假單胞菌和金黃色葡萄球菌）的效力，并同時(shí)作為這些產(chǎn)品標(biāo)簽聲明的法規(guī)指南。如果一家消毒產(chǎn)品供應(yīng)商希望在其廣譜消毒劑的標(biāo)簽上添加硬質(zhì)無孔表面去除生物膜的聲明，這些測試方法和指南為其提供了一個(gè)框架。

       在生物膜問題處理策略中，通常推薦使用標(biāo)簽上帶有生物膜去除聲明的廣譜消毒劑。

       預(yù)防性措施

       俗語有言："一份預(yù)防勝過十分治療"。通過以下措施前攝性地預(yù)防生物膜的形成是更好的策略。

       工藝設(shè)備的易清洗性。工藝設(shè)備的工程設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到易于清洗，如衛(wèi)生級設(shè)計(jì)和配件。

       使用合適的清洗試劑和清洗參數(shù)有效地去除工藝設(shè)備上的殘留。

       使用酸性清洗劑定期進(jìn)行不銹鋼設(shè)備的維護(hù)。

       優(yōu)化清洗/殺菌頻率以保持設(shè)備處于潔凈狀態(tài)。

       對于收集到的微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行例行的趨勢分析可以幫助管理者知曉工藝系統(tǒng)微生物控制的狀態(tài)以及對于不良趨勢可以采取早期介入。

       結(jié)論

       理解生物膜的生命周期、特性和處理方法十分重要。此外，制藥、生物制藥和醫(yī)療器械生產(chǎn)工藝中的生物負(fù)載控制取決于多種因素。這些因素包括有效的清洗工藝、良好的工程設(shè)計(jì)、定期的設(shè)備維護(hù)程序和持續(xù)性的檢測和趨勢分析。這些預(yù)防性的措施可以盡可能減少生產(chǎn)設(shè)施中的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)，確保任何生產(chǎn)出來的藥品對患者和消費(fèi)者都是安全的。

       參考文獻(xiàn)

       1) Pharmaceutical Technology Editors (Aug 22, 2018), King Bio Recalls Products Due to Microbial Contamination (http://www.pharmtech.com/king-bio-recalls-products-due-microbial-contamination)

       2) Lopolito, P., and E. Rivera. "An Audit Approach to Address Microbial Contamination in Process Equipment." In Contamination Control in Healthcare Product Manufacturing, 2013, co-published by PDA and DHI

       3) Cleanroom Technology, Strategies for Biofilm Remediation, A. Deal, D. Klein and P. Lopolito Jul 2015.

       4) STERIS internal document, Tech Tip #3088 - General Cleaning Recommendation for Removal of Microbial Residue

       作者簡介：

       Richard Chai

       技術(shù)服務(wù)經(jīng)理

       史帝瑞生命科學(xué)

       Richard Chai先生（以下簡稱Richard）目前任職史帝瑞技術(shù)服務(wù)經(jīng)理，致力于為客戶提供潔凈室清潔和微生物污染水平控制相關(guān)的技術(shù)培訓(xùn)（包括消毒劑驗(yàn)證、產(chǎn)品接觸表面的清潔和清潔驗(yàn)證）。他同時(shí)還是ISPE會議的講師。

       加入史帝瑞之前，Richard有過13年在干粉吸入器、生物無菌灌裝和包裝、醫(yī)療器械和生物醫(yī)藥設(shè)備制造和驗(yàn)證相關(guān)的工作經(jīng)驗(yàn)，因此對潔凈室的清潔和消毒要求、微生物污染水平控制的方法有深入的理解。Richard曾擔(dān)任過驗(yàn)證咨詢專家，對許多制藥客戶在設(shè)備驗(yàn)證、產(chǎn)品接觸表面的清潔驗(yàn)證、消毒劑驗(yàn)證和產(chǎn)品接觸/非接觸表面的清潔等方面提供驗(yàn)證技術(shù)支持。