01
簡介
COVID-19的大流行把mRNA**推向整個生物藥行業(yè)的C位，ioNTech/ Pfizer，Moderna已經(jīng)上市，在歐美廣泛接種。值得注意的是二者的遞送系統(tǒng)均為脂質(zhì)納米顆粒。**開發(fā)的速度也超出了預(yù)期，這些結(jié)果僅在SARS-CoV-2序列公開發(fā)布后10個月才出現(xiàn)。
與其他藥物形式（包括小分子，DNA，寡核苷酸，病毒系統(tǒng)和蛋白質(zhì)，包括抗體）相比，mRNA治療劑具有許多優(yōu)勢和若干挑戰(zhàn)。與DNA相比，mRNA僅需要進入細(xì)胞質(zhì)核糖體翻譯，而無需進入細(xì)胞核，因此不存在基因組整合的風(fēng)險。與蛋白質(zhì)和病毒系統(tǒng)相比，mRNA的生產(chǎn)過程無細(xì)胞，速度更快，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有天然的糖基化和構(gòu)象特性。當(dāng)與脂質(zhì)納米顆粒（LNP）輸送系統(tǒng)結(jié)合使用時。
02
技術(shù)平臺開發(fā)中的主要挑戰(zhàn)因素
自身的免疫原性、對酶促降解的敏感性導(dǎo)致不穩(wěn)定、裸mRNA難以被細(xì)胞攝取。mRNA的固有免疫原性歸因于細(xì)胞通過Toll樣受體（TLR），激活免疫系統(tǒng)，盡管這種激活可能有助于增強對mRNA**的免疫反應(yīng)，但直接的作用是通過eIF2a的PKR磷酸化來下調(diào)翻譯，這削弱了eIF2的活性，抑制了mRNA的翻譯，從而抑制了對蛋白質(zhì)合成。消除這種先天免疫應(yīng)答的主要方法是在序列中使用例如1-methylpseudouridine和其他存在tRNA和rRNA中的不常見的核苷酸而不是常見的核苷酸，是的固有免疫系統(tǒng)對他們不敏感。這種修飾技術(shù)已經(jīng)在在BioNTech / Pfizer和Moderna SARS-CoV-2**中使用，并且在臨床試驗中顯示出> 94％的有效效。另一種方式是CureVac所采用的：通過密碼子優(yōu)化和盡量不使用鳥苷酸，因為TLR7和TLR8主要識別富含GU的單鏈RNA序列。
mRNA治療的第二個挑戰(zhàn)是其對核酸酶的敏感性，例如血清中半衰期小于5分鐘。盡管siRNA的化學(xué)修飾在提高穩(wěn)定性和降低免疫原性方面非常成功，但迄今為止，由于翻譯機制對這些修飾的敏感性 ，它們尚未成功用于mRNA修飾。
mRNA的第三個挑戰(zhàn)是除未成熟的樹突狀細(xì)胞外，大多數(shù)細(xì)胞類型中缺乏裸露的mRNA的細(xì)胞攝取能力。通過合適的遞送系統(tǒng)攜帶mRNA可以解決這最后兩個挑戰(zhàn)，既可以保護mRNA不受酶的攻擊，又可以促進細(xì)胞的攝取。比如，在動物模型中使用脂質(zhì)納米顆粒載體系統(tǒng)與nakedmRNA相比，mRNA的表達(dá)效率可以提高1000倍。
03
遞送系統(tǒng)
這些臨床試驗中的所有mRNA遞送系統(tǒng)都是脂質(zhì)納米顆粒，輝瑞-BioNTech LNP和Moderna LNP的確切組成已公開披露，而其他一些則沒有，其他的都最有可能類似于Alnylam Onpattro™產(chǎn)品。
04
脂質(zhì)納米顆粒的組裝和結(jié)構(gòu)
目前，mRNA脂質(zhì)納米顆粒的生產(chǎn)方法利用微流體或T型接頭混合，將含有疏水性脂質(zhì)的乙醇相和含有mRNA的水相快速混合在pH值為4的緩沖液（如乙酸）中。微流體混合的優(yōu)勢在于能夠?qū)⒁掖贾械臉O少量脂質(zhì)與水溶液中的mRNA（數(shù)十微升）混合，從而可以篩選許多組分和配方參數(shù)。
另一方面，T-mixing是商業(yè)生產(chǎn)大批mRNA LNP（例如當(dāng)前臨床試驗中的LNP）的通用選擇方法。最近的文獻(xiàn)證明這兩種方法均可以生產(chǎn)大小和形態(tài)相似的LNP顆粒，將最終生產(chǎn)的顆粒尺寸限制為<100 nm，其中兩種溶液的快速混合是關(guān)鍵。由這些溶液組裝和形成LNP的過程是由疏水力和靜電力共同驅(qū)動的。四種脂質(zhì)（可電離脂質(zhì)，DSPC，膽固醇，PEG-脂質(zhì)）最初可溶于乙醇，而沒有其他可中和的離子，因此可電離的脂質(zhì)為非質(zhì)子化且電中性。通常將一體積的含脂質(zhì)的乙醇溶液與三體積的mRNA在pH = 4的醋酸鹽緩沖液中混合，這樣，當(dāng)脂質(zhì)與含水緩沖液接觸時，它們變得不溶于3：1的水/乙醇溶劑和可電離的脂質(zhì)變成質(zhì)子化并帶正電荷，然后驅(qū)使它與mRNA的帶負(fù)電荷的磷酸骨架靜電結(jié)合，形成包裹mRNA的脂質(zhì)顆粒并在水溶液中懸浮液中。
該過程中的關(guān)鍵成分是PEG-脂質(zhì)，因為PEG鏈?zhǔn)怯H水性的，因此可以包覆顆粒，并決定其最終的熱力學(xué)穩(wěn)定尺寸。通過改變PEG的摩爾分?jǐn)?shù)，可控制LNP的大小，例如100 nm顆粒時PEG-脂質(zhì)為0.5％摩爾分?jǐn)?shù)，43 nm 顆粒粒徑事PEG-脂質(zhì)為3％摩爾分?jǐn)?shù)。
最近一項重要數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)將mRNA LNP懸浮液在水性緩沖液中稀釋或在水性緩沖液中透析以提高pH值并消除乙醇時，LNP的結(jié)構(gòu)和大小在混合后仍在繼續(xù)變化。水相和脂質(zhì)相的初始混合產(chǎn)生的pH值接近5.5，使可電離脂質(zhì)質(zhì)子化，其LNP pKa值接近6.5，并促使mRNA結(jié)合和封裝。隨后通過稀釋、透析或切向流過濾提高pH值，可中和可電離的脂質(zhì)，當(dāng)可電離脂質(zhì)變?yōu)橹行詴r，它的溶解度也降低，導(dǎo)致形成較大的疏水性脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域，從而驅(qū)動LNP的融合過程，從而增大其尺寸，LNP的核心變成非晶態(tài)的電子致密相，主要是含有與mRNA結(jié)合的可電離脂質(zhì)。據(jù)估計，在此過程中，多達(dá)36個囊泡可融合形成僅一個最終的LNP。這項研究以及另一項使用中子散射方法的研究也表明，DSPC在LNP外圍PEG層的下方形成一個雙層，其中心核心主要是與mRNA結(jié)合的可電離脂質(zhì)。
05
遞送系統(tǒng)性能的決定因素
mRNA傳遞系統(tǒng)的性能決定因素是多因素的且相互作用的，包括：（1）它們傳遞至合適細(xì)胞并有效釋放mRNA到細(xì)胞質(zhì)進行翻譯的效率；（2）佐劑，可增強免疫反應(yīng)，已知脂質(zhì)納米顆粒具有其自身的佐劑活性；（3）將注射部位過度炎癥或全身分布和脫靶表達(dá)可能引起的不良事件或**的影響降至最低。4）劑量：在SARS-CoV-2臨床試驗中，目前正在追求的大劑量劑量最容易理解mRNA遞送系統(tǒng)的效力，從1到100 μg。人體試驗中的劑量明顯分為高劑量的核苷修飾RNA（Moderna，BioNTech）30–100 μg，未修飾的RNA（CureVac，Translate Bio）較低的7.5–20 μg，甚至低劑量的10–10 μg；5）LNP最常引用的決定其效價或遞送效率的特征是其pKa。pKa是LNP中50％的可電離脂質(zhì)質(zhì)子化的pH。一個很好的解釋這種pKa依賴性的模型是基于LNP中的可電離脂質(zhì)在pH 7.4時接近中性，而在內(nèi)化進入細(xì)胞后，內(nèi)體的pH值隨著通過內(nèi)溶酶體途徑的發(fā)展而開始下降。使可離子化的脂質(zhì)質(zhì)子化，然后將其與內(nèi)體的陰離子內(nèi)源性磷脂結(jié)合并破壞其雙層結(jié)構(gòu)，從而將mRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中通過核糖體進行翻譯。
06
結(jié)論
在過去的二十年中，mRNA治療技術(shù)取得了非凡的進展，首先是確定了使用修飾的核苷和序列工程技術(shù)來控制mRNA固有免疫原性的方法，以及在**和其他治療適應(yīng)癥中應(yīng)用mRNA的方法。與以前的系統(tǒng)相比，采用siRNA傳遞中使用的脂質(zhì)納米顆粒原型導(dǎo)致傳遞效率提高了一個數(shù)量級，并且仍在不斷提高，這主要歸功于新型可電離脂質(zhì)的設(shè)計。mRNA LNP結(jié)構(gòu)、功能、效價、靶向性和生物學(xué)特征（如佐劑性）的許多方面仍有待探索，以便充分利用這種強大的轉(zhuǎn)化治療方式的潛力。
參考文獻(xiàn)：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7836001/， Nanomaterial Delivery Systems for mRNA Vaccines.
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