01

       PROTAC的歷史發(fā)展

       圖1. PROTAC技術(shù)的原理——泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑，來源：Swatek, Kirby N, and David Komander. “Ubiquitin modifications.” Cell research vol. 26,4 (2016): 399-422.

       2004年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了發(fā)現(xiàn)泛素調(diào)節(jié)的蛋白降解途徑的三位科學(xué)家，這是一種泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）參與的蛋白降解途徑。首先通過消耗1分子ATP激活泛素小分子，使它與一種泛素激活酶E1形成復(fù)合物，隨后這個(gè)泛素分子又轉(zhuǎn)移到了泛素結(jié)合酶E2上形成復(fù)合物，當(dāng)泛素連接酶E3識(shí)別結(jié)合底物蛋白時(shí)，這個(gè)復(fù)合物會(huì)緊接著和它結(jié)合，泛素就會(huì)直接或者間接地從E2轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。

       泛素小分子的羧基端會(huì)和底物蛋白的Lys上的賴氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，當(dāng)這個(gè)泛素傳遞的過程重復(fù)發(fā)生多次后，泛素根據(jù)其自身不同的結(jié)合位點(diǎn)以一些特定的方式聚集，就會(huì)使這個(gè)底物蛋白被蛋白酶體降解，隨后通過去泛素化作用，這些泛素分子可以被循環(huán)利用。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細(xì)胞內(nèi)80%以上的蛋白降解過程。

       圖2. PROTAC技術(shù)的基本原理，來源：Li, Xin, and Yongcheng Song. “Proteolysis-targeting chimera (PROTAC) for targeted protein degradation and cancer therapy.” Journal of hematology & oncology vol. 13,1 50. 13 May. 2020

       本文所介紹的PROTAC這項(xiàng)技術(shù)，全稱是PROteolysis-Targeting Chimeras，即靶向蛋白水解的嵌合體，它的原理就是依賴于這條泛素化的蛋白降解途徑。

       在結(jié)構(gòu)上，PROTAC包括三個(gè)部分：一個(gè)E3泛素連接酶配體和一個(gè)靶蛋白配體，兩個(gè)活性配體通過特殊設(shè)計(jì)的“Linker”結(jié)構(gòu)連接在一起，最終形成了三聯(lián)體的“PROTAC”的活性形式，這樣的化學(xué)分子既可以結(jié)合E3泛素連接酶，又可以結(jié)合胞內(nèi)蛋白質(zhì)，它相當(dāng)于一把“雙向抓手”，通過把靶向的蛋白質(zhì)招募到E3泛素連接酶附近來實(shí)現(xiàn)靶向蛋白質(zhì)的多泛素化，最后被蛋白酶體識(shí)別和降解。

       在這個(gè)過程中，PROTAC可以循環(huán)使用，因?yàn)樗旧頉]有跟泛素結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)，所以不被蛋白酶體降解。

       圖3. PROTAC研究歷史——1995年報(bào)道第一個(gè)人工誘導(dǎo)的蛋白降解，來源：Gosink, M M, and R D Vierstra. “Redirecting the specificity of ubiquitination by modifying ubiquitin-conjugating enzymes.” PNAS vol. 92,20 (1995): 9117-21

       這種人工誘導(dǎo)的蛋白降解最早報(bào)道是在1995年，研究者設(shè)計(jì)出了一系列可以與IgG結(jié)合嵌合的E2結(jié)合酶，他們的創(chuàng)新思路是把一個(gè)蛋白結(jié)合域附加到E2結(jié)合酶的C端，從而形成一個(gè)含有靶蛋白結(jié)合域的E2嵌合體，這個(gè)嵌合體就會(huì)基于自身的性質(zhì)去特異性識(shí)別并且泛素化相應(yīng)的靶蛋白。

       他們選擇了一種E2結(jié)合酶（UBC4）和protein A嵌合，protein A可以特異性識(shí)別多種IgG抗體。這種構(gòu)造的E2嵌合體具有很好的原始E2的活性，可以結(jié)合泛素。它能夠顯著促進(jìn)靶蛋白IgG的泛素化，這種E2嵌合體的特異性與protein A一致，由于proteinA能夠識(shí)別鼠和兔的IgG而不識(shí)別山羊的IgG，因此該嵌合體也能夠識(shí)別鼠和兔的IgG而不識(shí)別山羊的IgG。而且這些人工誘導(dǎo)的泛素化特征是可以被蛋白酶體識(shí)別降解的。這項(xiàng)基于E2嵌合體的創(chuàng)新研究，首次實(shí)現(xiàn)人工誘導(dǎo)蛋白降解，為PROTAC技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

       圖4. PROTAC研究歷史——2001年提出PROTAC概念并設(shè)計(jì)出首 個(gè)PROTAC分子，來源：Sakamoto, K M et al. “Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.” PNAS vol. 98,15 (2001): 8554-9.

       2001年，耶魯大學(xué)的Craig Crews教授與加州理工學(xué)院的Ray Deshaies教授聯(lián)手發(fā)表了一篇具有里程碑意義的論文，他們利用含SCFβ-TRCP的E3誘導(dǎo)了MetAp-2的降解，首次引入了靶向嵌合蛋白水解（PROTAC）一詞，他們將他們?cè)O(shè)計(jì)的PROTAC分子命名為PROTAC-1，它的一端是E3連接酶的配體，IκBα 磷酸肽，另一端是靶蛋白MetAP-2配體，血管生成抑制劑ovalicin，利用這把“雙向抓手”，把靶蛋白MetAP-2招募到SCFβ-TRCP上，實(shí)現(xiàn)泛素化和蛋白酶體降解。

       他們成功合成出了這樣的PROTAC-1分子，并且證實(shí)了它降解靶蛋白的能力。當(dāng)在體系中加入了LLnL(一種蛋白酶體抑制劑時(shí)），降解能力受到抑制，證明了這個(gè)PROTAC-1分子確實(shí)是依賴蛋白酶體催化靶蛋白的降解。但是PROTAC-1作為第一代PROTAC分子也表現(xiàn)出一個(gè)顯著的缺點(diǎn)，它含有一個(gè)分子量比較大的肽類的配體，從而限制了它的細(xì)胞膜滲透性，同時(shí)它也不具有很好的穩(wěn)定性，細(xì)胞活性低，因此限制了它的可應(yīng)用性，無法應(yīng)用到藥物開發(fā)中。

       圖5. PROTAC研究歷史——2008年報(bào)道首 個(gè)全小分子PROTAC，來源：Schneekloth, Ashley R et al. “Targeted intracellular protein degradation induced by a small molecule: En route to chemical proteomics.” Bioorganic & medicinal chemistry letters vol. 18,22 (2008): 5904-8.

       2008年，這個(gè)含有肽的問題得到了解決，報(bào)道了第一個(gè)全小分子的PROTAC。這項(xiàng)研究中合成了能夠靶向降解雄激素受體（AR）的SARM-nutlin PROTAC小分子，其中Nutlin是一種咪唑啉衍生物，研究中發(fā)現(xiàn)它可以與E3連接酶MDM2的天然底物p53競爭性結(jié)合MDM2，因此可以作為E3連接酶配體。

       在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將其作用于瞬時(shí)表達(dá)AR的HeLa細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)這個(gè)小分子表現(xiàn)出比較好的細(xì)胞滲透性、穩(wěn)定性和一定的降解能力，但其細(xì)胞活性仍不理想，小分子在10μM濃度下才能有效誘導(dǎo)AR降解，因此仍然限制了它的成藥性。

       圖6. HIF-1α與VHL蛋白相互作用（左）；一類具有高親和力的VHL配體（右），來源：Buckley, Dennis L et al. “Targeting the von Hippel-Lindau E3 ubiquitin ligase using small molecules to disrupt the VHL/HIF-1α interaction.” Journal of the American Chemical Society vol. 134,10 (2012): 4465-8.

       2010-2012年，隨著Craig Crews團(tuán)隊(duì)和Alessio Ciulli及其他合作者發(fā)現(xiàn)了更多泛素E3連接酶的結(jié)合體，在類藥E3結(jié)合配體的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化方面，PROTAC取得了重大的進(jìn)展。

       例如發(fā)現(xiàn)了methyle bestatin(MeBS)可以作為IAP E3連接酶配體，產(chǎn)生了IAP-based PROTAC；

       還發(fā)現(xiàn)沙利度胺（thalidomide）這個(gè)明星藥物可以作為CRBN E3連接酶配體，產(chǎn)生了CRBN-based PROTAC。

       2012年，VHL的高親和力擬肽配體被發(fā)現(xiàn)，HIF-1α（缺氧誘導(dǎo)因子）是一種轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下被激活，上調(diào)促紅細(xì)胞生成素，血管內(nèi)皮生長因子，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白等的表達(dá)。它可以與E3連接酶中的VHL相互作用，被泛素化并進(jìn)入蛋白酶體降解途徑。對(duì)這條降解途徑的抑制可以有效替代慢性貧血等由于缺乏HIF-1α引起的疾病治療藥物。

       結(jié)合以前旨在抑制這條途徑展開的VHL抑制劑小分子的設(shè)計(jì)研究，研究者開展了對(duì)于VHL配體的篩選和優(yōu)化，獲得了具有高親和力的配體，設(shè)計(jì)出了VHL-based PROTAC分子。（右圖分子式為一類優(yōu)化的VHL配體）

       圖7. ARVINAS公司和Craig Crews教授

       這種把VHL的抑制劑小分子研究應(yīng)用到PROTAC設(shè)計(jì)中的組合理念，促成了Craig Crews教授創(chuàng)辦生物技術(shù)公司Arvinas，該公司專注于PROTAC技術(shù)，開發(fā)創(chuàng)新藥物，使得PROTAC技術(shù)得以迅速地發(fā)展。Arvinas基于VHL配體設(shè)計(jì)的PROTAC化合物具有更多類藥特性，可以大幅度提高細(xì)胞的穿透性，細(xì)胞活性可以達(dá)到納摩爾級(jí)別。

       圖8. PROTAC研究歷史——PROTAC分子在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)催化下調(diào)蛋白水平，來源：Bondeson, Daniel P et al. “Catalytic in vivo protein knockdown by small-molecule PROTACs.” Nature chemical biology vol. 11,8 (2015): 611-7.

       2015年這個(gè)團(tuán)隊(duì)發(fā)表了一項(xiàng)重要研究，他們?cè)O(shè)計(jì)了兩種基于VHL E3 ligase的小分子PROTAC，一種帶有雌激素相關(guān)受體（ERRα）的配體，另一種是RIPK1蛋白激酶的配體，中間通過linker與高親和性的VHL配體連接，靶蛋白的水平與癌癥、自身免疫性疾病發(fā)病有關(guān)的。

       這兩個(gè)小分子PROTAC都表現(xiàn)出劑量依賴性，但是當(dāng)PTORAC小分子濃度過高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)三元復(fù)合物中常見的hook effect，降解靶蛋白的能力反而下降。這是因?yàn)楫?dāng)PROTAC小分子濃度過高時(shí)，以形成二元復(fù)合物為主，而三元復(fù)合物的形成受到了抑制(如上圖)。

       這項(xiàng)研究還證實(shí)了這樣的小分子PROTAC可以通過注射到小鼠體內(nèi)，進(jìn)入不同部位，然后降低其體內(nèi)不同器官中的相應(yīng)靶蛋白水平。從而說明PROTAC能夠劑量依賴性地下調(diào)靶蛋白的水平，并且在小鼠體內(nèi)有效發(fā)揮作用。

       有了這些研究的基礎(chǔ)，利用PROTAC技術(shù)進(jìn)行小分子藥物開發(fā)有了廣闊的前景，但是PROTAC技術(shù)具體是怎么設(shè)計(jì)元件的，以及如何突破許多瓶頸在體內(nèi)工作？

       02

       PROTAC設(shè)計(jì)與工作

       簡單回顧一下PROTAC的工作原理：由linker連接的兩個(gè)配體分別靶向目標(biāo)蛋白（POI）和酶E3，拉近兩者距離，以促進(jìn)泛素轉(zhuǎn)移，從而使POI跳過常規(guī)UPS步驟，“半路出家”走向被蛋白酶體識(shí)別、降解的不歸路。箭頭箭柄和兩個(gè)靶標(biāo)，互相靠近后，產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，磨擦出火花——不難看出，PROTAC似乎扮演“丘比特之箭”的角色，盡管這是一支“分手箭”。

       丘比特之箭的一生可分為四個(gè)階段：

       鑄箭，巧婦難為無米之炊，一支恰到好處的箭是愛神降臨的資本；

       瞄準(zhǔn)，亂點(diǎn)鴛鴦譜將會(huì)釀成悲??；

       射箭，神仙眷侶的相逢也需要天時(shí)地利；

       箭效，色厲內(nèi)荏還是內(nèi)外兼修，只有正確引導(dǎo)結(jié)局走向的箭才擁有圓滿一生。

       相應(yīng)地，PROTAC的設(shè)計(jì)與工作歷程也可以“四步走”，即對(duì)PROTAC的量與質(zhì)的設(shè)計(jì)、PROTAC靶向性方面的特點(diǎn)、提高PROTAC可控性的策略以及對(duì)PROTAC執(zhí)行力的評(píng)估。

       1 鑄箭——PROTAC設(shè)計(jì)

       PROTAC的自我修養(yǎng)有哪些？簡單來說，合適配體和合適連接體是其達(dá)到及格線的第一步。

       配體選擇需因物制宜：對(duì)POI保證親和性，對(duì)E3還需格外注意其泛素轉(zhuǎn)移酶活性的保留。連接體則要“揚(yáng)長避短”，盡可能降低對(duì)藥物入膜的不利影響，同時(shí)穩(wěn)定三元復(fù)合物，達(dá)到“不惹事也不怕事”的效果。

       目前PROTAC設(shè)計(jì)日臻完善（圖9），干實(shí)驗(yàn)與濕實(shí)驗(yàn)結(jié)合，借助計(jì)算機(jī)模擬、藥效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及復(fù)合物結(jié)構(gòu)信息有效地挖掘小分子化合物庫，并不斷優(yōu)化藥物。

       圖9. PROTAC研發(fā)流程圖，來源：Bond, Michael J, and Craig M Crews. “Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come of age: entering the third decade of targeted protein degradation.” RSC chemical biology vol. 2,3 725-742. 19 Mar. 2021, doi:10.1039/d1cb00011j

       其中配體設(shè)計(jì)與篩選始終是研究熱點(diǎn)。配體類別上，除了傳統(tǒng)的經(jīng)改良的小分子化合物，核酸分子也已被開發(fā)為POI配體，在靶向轉(zhuǎn)錄因子方面表現(xiàn)不俗（圖10）。

       配體靶標(biāo)相互作用上，一方面是相互作用方式，配體能直接或間接結(jié)合靶標(biāo)，比如借助囊泡膜蛋白這一橋梁，配體與囊泡結(jié)合，囊泡則靶向POI，從而拉近POI與E3。另一方面則是相互作用強(qiáng)弱。相互作用強(qiáng)意味著三元復(fù)合物十分穩(wěn)定，PROTAC對(duì)靶標(biāo)“死心塌地”，甚至“殉情”，淪為“一次性”藥物。相互作用弱雖然提高復(fù)合物不穩(wěn)定的風(fēng)險(xiǎn)，但PROTAC可以“快刀斬亂麻”，快速抽身而投入下一輪降解，提高整體降解速率。面臨向穩(wěn)還是向快的岔路口，近些年來嶄露頭角的可逆共價(jià)PROTAC或許能夠另辟蹊徑。

       圖10. 靶向轉(zhuǎn)錄因子的PROTAC工作示意圖，藍(lán)紅螺旋即為核酸分子，與轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合從而拉近E3與POI，圖片來源：Hu, Zhenyi, and Craig M Crews. “Recent Developments in PROTAC-Mediated Protein Degradation: From Bench to Clinic.” Chembiochem : a European journal of chemical biology, 10.1002/cbic.202100270. 8 Sep. 2021, doi:10.1002/cbic.202100270

       圖11. 兩種高效篩選配體的方法工作示意圖。左圖為chemo proteomic competition，右圖為DNA encoded library。圖片來源：Bond, Michael J, and Craig M Crews. “Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come of age: entering the third decade of targeted protein degradation.” RSC chemical biology vol. 2,3 725-742. 19 Mar. 2021, doi:10.1039/d1cb00011j

       方法論上，近年出現(xiàn)兩種配體高效篩選的策略（圖3）。一是chemo proteomic competition，它是指對(duì)細(xì)胞或機(jī)體所有蛋白質(zhì)，設(shè)置僅有待測配體和待測配體與已知共價(jià)配體競爭性結(jié)合的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，通過比較與興趣蛋白結(jié)合的兩種配體的比例評(píng)估待測配體與蛋白質(zhì)的親和力。

       二是DNA encoded library，即將小分子化合物與DNA連接而對(duì)其進(jìn)行“DNA編碼”后再與靶標(biāo)蛋白混合進(jìn)行親和篩選，最后通過DNA序列按圖索驥，鎖定潛在配體。通過工作原理可以初步推斷，兩者分別側(cè)重于篩選共價(jià)結(jié)合配體和非共價(jià)結(jié)合配體。

       PROTAC的元件及其品質(zhì)初步達(dá)標(biāo)后，接下來要考慮的問題是，打造多少支醫(yī)藥丘比特之箭恰到好處？由于三元復(fù)合物往往呈現(xiàn)鐘形動(dòng)力學(xué)曲線，所以PROTAC與有效復(fù)合物并不呈現(xiàn)簡單的正相關(guān)關(guān)系。

       此外，某些PROTAC形成三元復(fù)合物時(shí)具有正協(xié)同效應(yīng)，加之可循環(huán)PROTAC的“催化”特性，低劑量高療效成為PROTAC的一塊金字招牌。總之，PROTAC設(shè)計(jì)的質(zhì)與量，在精不在多。

       2 瞄準(zhǔn)——PROTAC靶向性

       圖12. PROTAC靶向的POI發(fā)展時(shí)間線，來源：Bond, Michael J, and Craig M Crews. “Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come of age: entering the third decade of targeted protein degradation.” RSC chemical biology vol. 2,3 725-742. 19 Mar. 2021, doi:10.1039/d1cb00011j

       目前PROTAC已被證明能夠有效降解支架蛋白、蛋白復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄因子和undruggable蛋白這四類被普遍認(rèn)為缺少有效結(jié)合小分子藥物位點(diǎn)的POI（圖4）。相較于POI“百花齊放”的喜人之勢，VHL、CRBN等從發(fā)展初期就被使用的酶幾乎壟斷了E3連接酶選擇。

       有趣的是PROTAC似乎是一支不鋒利的神箭，低親和力配體也能以較高選擇性靶向目標(biāo)。這種現(xiàn)象可能是由于“精心設(shè)計(jì)”的linker對(duì)三元復(fù)合物起額外的穩(wěn)定作用，發(fā)揮了上文提到的“不怕事”作用。換言之，只要配體自身實(shí)力尚可，有強(qiáng)大背景加持仍能“出道”——不過這仍需要精妙的PROTAC設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)。

       3 射箭——PROTAC可控性

       神箭之外，天時(shí)地利也格外重要。

       首先我們要借助外源信號(hào)讓PROTAC“伺機(jī)而動(dòng)”，定時(shí)起效。一種策略是光控制，它又可分為“光籠法”和“光開關(guān)”兩種方法（圖5）。

       前者是在PROTAC的配體上添加“光籠基團(tuán)”以鈍化正常狀態(tài)下的PROTAC，經(jīng)特定波長光照射后“光籠基團(tuán)”脫落，實(shí)現(xiàn)不可逆的PROTAC啟動(dòng)。

       后者則是在PROTAC的linker中引入偶氮苯基團(tuán)，切換不同波長的光會(huì)改變linker的順反構(gòu)型，而只有一種構(gòu)型有利于三元復(fù)合物形成，這樣便形成可逆PROTAC開關(guān)。

       胞外信號(hào)分子也是一個(gè)有力把手。比如篩選出特定結(jié)合位點(diǎn)，使得只有磷酸化的PROTAC才能與POI緊密結(jié)合，這樣便能夠通過定時(shí)添加生長因子，經(jīng)系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使PROTAC打上磷酸化標(biāo)簽，作為其“射箭資格證”。

       然而，PROTAC的時(shí)間可控性面臨藥物透膜性變差、光輻射誘變性以及組織特異性差等問題。

       圖13. 光控法示意圖。上圖為“光籠法”，橙色圓球即為光籠基團(tuán)。下圖為“光開關(guān)”，藍(lán)色部分即為引入的偶氮苯基團(tuán)。圖片來源：Bond, Michael J, and Craig M Crews. “Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come of age: entering the third decade of targeted protein degradation.” RSC chemical biology vol. 2,3 725-742. 19 Mar. 2021, doi:10.1039/d1cb00011j

       組織特異性問題恰恰與“地利”相對(duì)應(yīng)，即確保PROTAC在目標(biāo)組織或細(xì)胞發(fā)揮作用。形象地說，PROTAC和細(xì)胞猶如列車和乘客，對(duì)PROTAC的空間性控制則如同防范乘客逃票，一要抓上車前檢票，二要抓上車后查票。

       “檢票”，使持有特定marker的細(xì)胞攝入PROTAC。比如以腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的葉酸受體為“票據(jù)”，使與葉酸結(jié)合的PROTAC只能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。再比如利用抗原-抗體特異性結(jié)合作用，將PROTAC與抗體綁定，靶向特定細(xì)胞。

       “查票”，其原理是非目標(biāo)細(xì)胞即便攝取PROTAC，但由于胞內(nèi)缺少特定E3或蛋白酶體不識(shí)別復(fù)合物等啟動(dòng)降解的必要條件，無法搭乘PROTAC這班“死亡列車”。

       4 箭效——PROTAC執(zhí)行力

       醫(yī)藥丘比特之箭究竟箭效如何？理論上，PROTAC是典型的藥物差等生，在“類藥五原則”的及格線外掙扎，且其ADME尚未明朗，很難評(píng)估其生物利用度。

       實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)卻顯示PROTAC是一支潛力股。借助各類技術(shù)手段從POI降解效果、PROTAC主體地位驗(yàn)證以及毒副反應(yīng)檢測三個(gè)角度對(duì)PROTAC進(jìn)行評(píng)估后，我們往往能夠驚喜地發(fā)現(xiàn)，PROTAC療效高于理論預(yù)期。

       03

       PROTAC的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

       1 PROTAC的優(yōu)缺點(diǎn)

       首先第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是作用范圍更廣、活性更高、可靶向“不可成藥”靶點(diǎn)。傳統(tǒng)的小分子和抗體等都是通過“占據(jù)驅(qū)動(dòng)”的作用模式抑制靶蛋白的功能發(fā)揮治療疾病的作用，這種作用模式需要抑制劑或單抗具備較高的濃度才能夠占據(jù)靶點(diǎn)的活性位點(diǎn)，阻斷下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，據(jù)估計(jì)，人類細(xì)胞中80%的蛋白缺乏這樣的位點(diǎn)。

       圖14. 傳統(tǒng)小分子的“占據(jù)驅(qū)動(dòng)”，來源：Science. 2017, 355(6330): 1163-1167.

       PROTAC只是提供結(jié)合活性，觸發(fā)靶蛋白與E3酶結(jié)合從而引發(fā)降解這一事件，屬于“事件驅(qū)動(dòng)(event driven)”，不需要直接抑制目標(biāo)蛋白的功能活性，藥物不需要與目標(biāo)蛋白長時(shí)間和高強(qiáng)度的結(jié)合，因此可以靶向傳統(tǒng)難以成藥的蛋白（undruggable target）由于PROTAC只需要與目標(biāo)蛋白弱結(jié)合就可以特異性地“標(biāo)記”它，因此，目前蛋白質(zhì)組中80%不可成藥的蛋白可能都能夠用PROTAC技術(shù)來解決。

       圖15. PROTAC的“事件驅(qū)動(dòng)”。Science. 2017, 355(6330): 1163-1167.

       據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已經(jīng)有超過100種蛋白被成功降解。這些靶點(diǎn)包括：

       （1）激酶類，如RIPK2、BCR-ABL、EGFR、HER2、c-Met、TBK1、CDK2/4/6/9、ALK、Akt、CK2、ERK1/2、FLT3、PI3K、BTK、Fak等；

       （2）BET蛋白，如BRD2/4/6/9；

       （3）核受體，如AR、ER等；

       （4）其他蛋白，如MetAp-2、Bcl-xL、Sirt2、HDAC6、Pirin、SMAD3、ARNT、PCAF/GCN5、Tau、FRS2等。

       這其中就包括“不可成藥靶點(diǎn)”，如轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)蛋白pirin、表觀遺傳相關(guān)蛋白PCAF/GCN5等。另外，根據(jù)Nature 3月份的一項(xiàng)報(bào)告顯示，到2021年年底，將至少有15款蛋白降解劑（包含PROTAC和分子膠）進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

       講到不可成藥靶點(diǎn)，RAS（KRAS、HRAS和NRAS）肯定是繞不要過去的。作為癌癥中最常見的突變基因，RAS是肺癌、結(jié)直腸癌和胰 腺癌的重要驅(qū)動(dòng)因素。被發(fā)現(xiàn)和研究40多年來，一直沒有針對(duì)該靶點(diǎn)的藥物上市。終于在今年5月份，Amgen公司開發(fā)的KRAS-G12C不可逆抑制劑AMG510（Sotorasib）成功上市，總算是終結(jié)了該靶點(diǎn)的“不可成藥性”。

       雖然KRAS的不可成藥性被小分子抑制劑終結(jié)了，但是降解劑在該靶點(diǎn)仍然大有可為。針對(duì)KRAS-G12C突變，Crews等人在KRAS抑制劑AMG510和MRTX849的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成了相關(guān)的PROTAC，活性測定發(fā)現(xiàn)了具有良好降解活性的降解劑，這或許可以為進(jìn)一步攻克RAS提供新的解決方案。

       可以預(yù)見，利用PROTAC技術(shù)攻克的可能不只是G12C，對(duì)其他突變或許也能有所作為。

       圖16. 針對(duì)RAS靶點(diǎn)的相關(guān)PROTAC藥物活性測定

       第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是PROTAC在某些靶點(diǎn)上可實(shí)現(xiàn)小分子難以實(shí)現(xiàn)的選擇性。多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑Foretinib可以結(jié)合130多種激酶，Crews等人將其作為結(jié)合靶蛋白的配體，分別連接E3連接酶VHL（von Hippel-Lindau）和CRBN（cereblon）的配體得到相應(yīng)的PROTAC，結(jié)果顯示連接VHL和CRBN的PROTAC只能分別降解36和62種蛋白，而只有12種蛋白才能被這兩種PROTAC降解。

       2,4-二氨基嘧啶骨架是激酶抑制劑的常見骨架，EGFR、ALK、CDK、Jak等激酶的抑制劑都有用到其作為母核。但是該骨架形成的藥物分子大多都比較“臟”，也就是靶點(diǎn)選擇性比較差，經(jīng)常對(duì)其他很多激酶都有很強(qiáng)的抑制活性，開發(fā)過程中off target的脫靶效應(yīng)常常成為毒副作用的主要來源，影響新藥開發(fā)的成功率。

       Gray課題組基于該骨架合成的PROTAC雖然能夠結(jié)合190多種激酶，但是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中只能降解12和22種激酶，大大提高了靶點(diǎn)的選擇性。

       PROTAC技術(shù)第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不僅可以實(shí)現(xiàn)小分子抑制劑難以做到的選擇性，在提高活性方面也具有非常顯著的優(yōu)勢。以PROTAC技術(shù)應(yīng)用最早的靶點(diǎn)BET（BRD2/3/4）為例，秦沖等人發(fā)現(xiàn)的QCA570在細(xì)胞抗增殖活性方面表現(xiàn)出了明顯優(yōu)于JQ1等抑制劑的能力，JQ1等抑制劑的活性大都在納摩爾級(jí)水平，而QCA570的活性提高了三個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到了驚人的皮摩爾級(jí)水平。基于出色的體外細(xì)胞抗增殖活性，降解劑在體內(nèi)也表現(xiàn)出了強(qiáng)效抗腫瘤活性，而且呈現(xiàn)出給藥劑量低和給藥頻次也低的特點(diǎn)。這說明在類似BET等靶點(diǎn)中，PROTAC具有明顯的優(yōu)勢。

       圖17. PROTAC可以提高活性和安全性，來源：J Med Chem 2018, 61, 6685-6704.

       第四個(gè)優(yōu)點(diǎn)是克服藥物的耐藥性。小分子抑制劑或拮抗劑在臨床用藥過程中，不可避免的都會(huì)發(fā)生獲得性耐藥。比如EGFR-T790M和C797S耐藥等。雖然可以通過開發(fā)新一代的抑制劑，如第三代和第四代EGFR來解決耐藥問題，但是隨著新一代藥物的使用，新的耐藥也會(huì)隨之出現(xiàn)。PROTAC技術(shù)在克服耐藥方面已經(jīng)顯現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢。

       Crews、Jian Jin、張三奇、丁克和Gray等課題組都有相關(guān)EGFR-PROTACs的研究，旨在通過蛋白降解途徑克服耐藥突變或找尋突破抑制劑的蛋白降解療法。可以看出，第一、二、三、四代抑制劑作為結(jié)合靶蛋白EGFR的配體，都有被應(yīng)用到PROTAC的設(shè)計(jì)中。其中，Gray課題組將變構(gòu)抑制劑也應(yīng)用到了PROTAC當(dāng)中，并取得了不錯(cuò)的效果，能夠選擇性的降解不同的EGFR突變體，而規(guī)避對(duì)野生型的降解。體外抗細(xì)胞增殖活性也進(jìn)一步驗(yàn)證了這種選擇性。

       圖18. EGFR-PROTACs. [1] Cell Chem Biol 2018, 25, 67-77. [2] J Med Chem 2020, 63, 1216-1232. [3] Eur J Med Chem 2020, 189, 112061. [4] Eur J Med Chem 2020, 208, 112781. [5] Eur J Med Chem 2020, 192, 112199. [6] Angew Chem Int Ed 2020, 59, 14481.

       下表是PROTAC與其他幾種藥物的特征對(duì)比，可以看出PROTAC在多個(gè)方面都比已有的三種藥物更加優(yōu)異。除此之外，PROTAC還有其他優(yōu)點(diǎn)：

       （1）用量小，催化劑量即可；

       （2）清除蛋白堆積；

       （3）**低；

       （4）不依賴于親和力，可選擇性高；

       （5）克服靶蛋白突變/過表達(dá)引起的耐藥等。

       表1. PROTAC藥物與其他幾種藥物的特征對(duì)比

       2 PROTAC存在的缺點(diǎn)和挑戰(zhàn)

       首先是三聯(lián)體成藥性差。傳統(tǒng)的PK、PD模型可能不適用于PROTAC技術(shù)，PROTAC的催化特性以及相對(duì)復(fù)雜的三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，可能使得組織分布不遵循傳統(tǒng)的pH分布理論，還有可能出現(xiàn)靶點(diǎn)介導(dǎo)的藥物處置現(xiàn)象導(dǎo)致PK/PD復(fù)雜化，但因目前相關(guān)的體內(nèi)試驗(yàn)較少，還沒有建立出針對(duì)PROTAC技術(shù)應(yīng)用的的PK、PD模型。

       圖19. PROTAC三聯(lián)體成藥性差，圖源：http://new.qq.com/omn/20210322/20210322A0EICO00

       對(duì)于傳統(tǒng)的小分子藥物，可以用成藥性五原則對(duì)其進(jìn)行初步的判斷，但對(duì)于PROTAC來講這一規(guī)律已經(jīng)不能適用。PROTAC相當(dāng)于是雙靶點(diǎn)藥物，分子量相對(duì)一般的小分子藥物較大，在700道爾頓以上，有的甚至超過1000道爾頓。這可能會(huì)影響到分子的水溶性及透膜性，不利于采用口服方式給藥的方式。目前常用的方式是經(jīng)腹膜內(nèi)，皮下或靜脈內(nèi)注射方式給藥。

       第三個(gè)缺點(diǎn)是三元復(fù)合體形成困難。PROTAC發(fā)揮藥效必須與目標(biāo)靶蛋白和E3連接酶結(jié)合形成三元復(fù)合物。PROTAC分子太多或太少都不利于三元復(fù)合體的形成。成功形成三元復(fù)合體首先需要成功通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，然后控制濃度以避免藥物分子與靶蛋白和E3連接酶分別形成二元復(fù)合物（hook effect，鉤效應(yīng)），最后還要充分考慮靶蛋白與E3連接酶接觸區(qū)域的電荷排斥和立體結(jié)構(gòu)排斥。

       圖20. PROTAC三元復(fù)合體形成困難，來源：http://new.qq.com/omn/20210322/20210322A0EICO00

       與設(shè)計(jì)和定制siRNA或RNA相比，PROTAC開發(fā)周期相對(duì)較長。如下圖所示，PROTAC不僅需要蛋白質(zhì)的配體，還需要蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成PROTAC，這可能是一個(gè)耗時(shí)的過程，涉及大量的合成化學(xué)及藥物化學(xué)相關(guān)支持?；跇?biāo)記的系統(tǒng)(HaloPROTACs和dTAG)雖然繞過了發(fā)現(xiàn)階段，但也同時(shí)廢除了PROTAC系統(tǒng)在可移植性（無需對(duì)其基因進(jìn)行修飾）方面的優(yōu)勢。

       圖21. PROTAC的開發(fā)周期，來源：http://new.qq.com/omn/20210322/20210322A0EICO00

       除以上內(nèi)容，PROTAC還存在一些其他缺點(diǎn)與挑戰(zhàn)：

       （1）Linker的選取問題；

       （2）靶蛋白降解困難；

       （3）藥效性來源有待商榷；

       （4）可用的E3泛素連接酶數(shù)量有限；

       （5）PROTAC技術(shù)并非適用所有的蛋白質(zhì)或亞細(xì)胞位置等。

       04

       PROTAC的應(yīng)用與前景

       先講講它的應(yīng)用，前文講過了PROTAC從1995年到2015年的發(fā)展歷程，也是一步步的向著成藥性在發(fā)展。尤其是在2013年，[kru：z]建立了Arvinas之后，它在2015年首次被帶入了藥物應(yīng)用。而本部分的重點(diǎn)部分是AVS-110，AVS-378這兩個(gè)PROTAC分子。

       在2001年，[kru?z]等人合理地利用與泛素連接酶E3體系SCF結(jié)合的10肽，加上甲硫氨酰氨肽酶2的共價(jià)抑制劑，設(shè)計(jì)并合成了首 個(gè)用于降解MetAP2的PROTAC-1。蛋白試驗(yàn)驗(yàn)證了PROTAC-1可快速降解MetAP2，且它可以與那個(gè)共價(jià)抑制劑和10肽競爭性結(jié)合MetAP2和SCF。

       但是這個(gè)開創(chuàng)性的工作并沒有就此結(jié)束，研究者提出了更進(jìn)一步的問題。利用SCF的E3體系，是否可以設(shè)計(jì)不同的PROTAC用于降解其他致病蛋白？共價(jià)鍵蛋白抑制劑可以設(shè)計(jì)PROTAC，非共價(jià)鍵的天然底物能否用于設(shè)計(jì)PROTAC？PROTAC在蛋白水平試驗(yàn)有效，在細(xì)胞內(nèi)是否也能產(chǎn)生同樣的降解作用？

       帶著這些問題，他們選擇了與前列腺癌相關(guān)的雄激素受體（AR）和與乳腺癌相關(guān)的雌激素受體（ER）作為降解的目標(biāo)蛋白。很有意思是，這兩個(gè)靶蛋白成為了后來Arvinas公司也是目前全球推進(jìn)最快的PROTAC降解的蛋白。這兩張圖就是將AR和ER泛素化的示意圖。

       圖22. AR和ER泛素化的示意圖，來源：Kathleen M. Sakamoto, Kyung B. Kim, Rati Verma, Andy Ransick, Bernd Stein, Craig M. Crews, Raymond J.Deshaies,Development of Protacs to Target Cancer-promoting Proteins for Ubiquitination and Degradation

       那么讓我們先來看一下做這兩種藥的重要性。以前列腺癌為例，為什么我們說要給AR泛素化，去治療前列腺癌？

       那我們先來看看目前治療前列腺癌的方式：使用雄激素合成抑制劑阿比特龍和雄激素受體阻滯劑恩雜魯胺聯(lián)合治療，可以將疾病早期的未化療耐雄激素限制療法的前列腺癌患者中位總體生存期提高到53.6個(gè)月，另外提一下，被譽(yù)為癌癥治療新希望的免疫療法目前對(duì)耐雄激素限制療法的前列腺癌一點(diǎn)辦法也沒有，而且一般的前列腺癌都會(huì)演變成這種，患者平均中位生存時(shí)間僅12.3個(gè)月。但遺憾的是2012年獲FDA批準(zhǔn)，到現(xiàn)在還沒有進(jìn)口。

       為了降解ER和AR，研究者分別利用了其天然底物雌二醇（E2）和二氫睪脂酮（DHT），通過中間的Linker連接IκBα磷酸化的10肽，設(shè)計(jì)了PROTAC-2和PROTAC-3。這次用來設(shè)計(jì)PROTAC的小分子為天然底物的激動(dòng)劑，而非抑制劑，這說明設(shè)計(jì)PROTAC不一定非要選擇抑制劑，激動(dòng)劑也是可以的。

       接下來是前景部分。這里展示了8種常用E3連接酶以及超20個(gè)抗癌靶點(diǎn)，其前景不言而喻。只是目前來看，PROTAC雖然具有治療多種疾病的前景，但目前這類藥物主要被調(diào)查用于治療癌癥。

       表2. 小分子PROTAC成功靶向的關(guān)鍵癌癥靶點(diǎn)，表格來源：Khan S, He Y, Zhang X, Yuan Y, Pu S, Kong Q, Zheng G, Zhou D. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) as emerging anticancer therapeutics.

       PROTAC技術(shù)給我們的啟發(fā)就是，以后成藥不一定非要去找一個(gè)蛋白的抑制靶點(diǎn)，可以找這個(gè)蛋白隨意的一個(gè)靶點(diǎn)，只要足夠特異，不會(huì)引起off target**就行，然后把這個(gè)靶點(diǎn)的配體放在啞鈴的一端，就可以成藥。

       對(duì)于剛才講的XOR抑制也是如此，別嘌醇和非布司他都是XOR的抑制劑，可以只去找它的結(jié)合位點(diǎn)，不一定要抑制它，那就能做出一個(gè)幾乎沒有副作用的藥。

       關(guān)于筆者

       尋藥真理團(tuán)

       他們是南京大學(xué)新藥研發(fā)策略課程的學(xué)生，本篇為該課程中嚴(yán)玉、朱菲、李曉煒、苗聲宇4位同學(xué)共同完成。

       他們朝氣蓬勃、他們斗志昂揚(yáng)，他們腳踏實(shí)地學(xué)習(xí)新藥研發(fā)知識(shí)，他們堅(jiān)信吾愛吾師吾更愛真理。

       他們是新一代醫(yī)藥行業(yè)接班人，他們是新藥研發(fā)領(lǐng)域的未來之光！

       參考文獻(xiàn)：

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