蛋白降解靶向嵌合體技術(shù)（PROTAC），是利用異雙功能小分子化合物將靶蛋白和細(xì)胞內(nèi)E3連接酶拉近，利用生物體內(nèi)泛素-蛋白酶體蛋白降解途徑特異性降解靶蛋白。PROTAC分子由3部分組成，一端是特異性E3連接酶配體，另一端是靶蛋白的特異性配體，以及中間的連接子，從而組成“靶蛋白-PROTAC-E3連接酶”三元復(fù)合物。

       自20多年前報(bào)道了第一個(gè)PROTAC小分子，靶向蛋白降解技術(shù)已從學(xué)術(shù)研究走向工業(yè)界，許多生物技術(shù)和醫(yī)藥行業(yè)已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)臨床前和早期臨床項(xiàng)目研究。2019年，第一個(gè)PROTAC分子進(jìn)入了臨床試驗(yàn)；2020年，針對兩個(gè)已確定的癌癥靶點(diǎn)：雌激素受體(ER)和雄激素受體(AR)完成了臨床概念驗(yàn)證。隨后，來自Bristol Myers Squibb (BMS)、Nurix Therapeutics、Kymera Therapeutics、Dialec Therapeutics、Foghorn Therapeutics等公司的降解劑也進(jìn)入了臨床研究。

       PROTAC在分子水平上的開發(fā)過程如圖所示，包括選擇靶標(biāo)，設(shè)計(jì)合成PROTAC分子，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其降解能力、降解機(jī)制、三元復(fù)合物的形成、降解選擇性、以及最后的藥代及藥效等。

       PROTAC靶向蛋白降解技術(shù)在臨床上完成了概念驗(yàn)證后，各種衍生的蛋白降解技術(shù)紛紛出現(xiàn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域新的應(yīng)用場景不斷被發(fā)掘。首批完成概念臨床試驗(yàn)的PROTAC藥物靶向成熟靶點(diǎn)，具備成為“best-in-class”藥物的潛力。接下來將介紹未來PROTAC的發(fā)展方向。

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       優(yōu)化PROTAC分子的理化性質(zhì)

       1997年引入的Role5有助于識(shí)別可能具有高口服生物利用度的候選藥物（MW≤500，logP≤5，H鍵供體≤5，H鍵受體≤10）。隨著PROTAC的研究進(jìn)展，與良好的藥代動(dòng)力學(xué)特征相關(guān)的理化性質(zhì)將可以預(yù)測。例如：通過搜索Roche化合物庫，Cantrill等人發(fā)現(xiàn)PROTAC分子符合PSA、MW和AlogP的3D圖中的bRo5空間，并且三者都有隨時(shí)間減少的趨勢。此外，即使PROTACs具有多個(gè)電離中心，精確的pKa值也可以通過完整的PROTAC分子來測量。并且可以通過色譜法來測量分布系數(shù)logD。

       滲透率最好通過細(xì)胞滲透率測定來確定，因此需要優(yōu)化培養(yǎng)條件，但目前PAMPA可能不適用于降解劑的滲透性評價(jià)。在水介質(zhì)中，可以利用熱力學(xué)溶解度實(shí)驗(yàn)來測量滲透率。此外，在研究具有環(huán)基團(tuán)的分子時(shí)，應(yīng)充分考慮分子的柔韌性。酰胺-酯取代策略可用于改善類似protac模型化合物的理化性質(zhì)。目前已經(jīng)開發(fā)了多參數(shù)評分函數(shù)ABMPS等指標(biāo)，為這類化合物的設(shè)計(jì)提供指南(AB-MPS評分越低，吸收的可能性越高)。

       目前大多數(shù)研究都集中在CRBN靶向分子上，因?yàn)镮MiDs的分子量較低，氫鍵供體和受體數(shù)量較少，脂溶性較高，符合口服化合物的原則。在AstraZeneca PROTAC分子文庫中發(fā)現(xiàn)，使用沙利度胺/泊馬度胺/來那度胺衍生的CRBN E3連接酶配體的多個(gè)PROTAC分子，口服生物利用度(>30%)相對較高。

       目前研究人員獲得以下結(jié)論：1、基于CRBN配體的PROTAC比基于VHL配體的口服利用度更高。2、色譜LogD7.4值在4.5 ~ 6.5之間時(shí)可能會(huì)獲得理想的口服生物利用度。3、口服生物利用度高的PROTACs會(huì)違反Ro5的2 ~ 3項(xiàng)。

       總體而言，與小分子藥物相比，PROTAC的理化性質(zhì)預(yù)測仍處于分散探索階段，尚未形成明顯規(guī)律，但未來“PROTAC Role 5”一定會(huì)出現(xiàn)并完善。

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       計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)PROTAC分子

       在PROTAC這個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，需要合成大量的類似物來探索結(jié)構(gòu)變化，以鑒定有效的降解劑。在沒有大量試驗(yàn)和錯(cuò)誤的情況下合理有效地設(shè)計(jì)PROTACs仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。目前利用計(jì)算機(jī)輔助高效設(shè)計(jì)protac和預(yù)測形成的三元配合物的結(jié)構(gòu)已成為趨勢。此外，對接模擬和分子動(dòng)力學(xué)已被用于發(fā)現(xiàn)最 佳連接體長度和理想位置。

       3

       擴(kuò)大E3連接酶

       在PROTAC分子的應(yīng)用范圍

       值得注意的是，E3連接酶在PROTAC領(lǐng)域的開發(fā)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，只有一小部分E3連接酶到了利用。有超過600個(gè)人類基因組編碼的泛素E3連接酶有待探索，雖然基于募集CRBN和VHL連接酶的PROTAC分子設(shè)計(jì)已經(jīng)日漸成熟，但它們的臨床前和臨床期開發(fā)仍然面對多重挑戰(zhàn)。尤其在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，對治療藥物的耐藥性可以迅速出現(xiàn)，腫瘤可能通過產(chǎn)生基因突變，逃避依賴非必需連接酶（比如CRBN和VHL）的蛋白降解劑作用。這些挑戰(zhàn)為開發(fā)新的E3連接酶提供了機(jī)會(huì)。

       E3連接酶作為靶蛋白和E2泛素結(jié)合酶(E2-ub)之間的支架，通過結(jié)合兩種分子，然后催化泛素從E2的活性位點(diǎn)半胱氨酸轉(zhuǎn)移到靶蛋白的賴氨酸側(cè)鏈上。泛素連接酶通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)這一催化作用。因此可以根據(jù)使用的泛素的連接策略將人類基因組中的E3連接酶分為以下幾類。

       簡單概括一下：最大的一類泛素連接酶是RING連接酶，可以同時(shí)與靶蛋白和E2-Ub結(jié)合，并將泛素直接轉(zhuǎn)移到靶蛋白的賴氨酸殘基上。第二類，HECT連接酶，首先結(jié)合靶點(diǎn)，先將泛素轉(zhuǎn)移到自己身上，形成E3-泛素復(fù)合物，再將泛素轉(zhuǎn)移到靶點(diǎn)上。第三類：RBR連接酶，是RING和HECT連接策略的結(jié)合。

       在早期關(guān)于激酶可降解性研究的基礎(chǔ)上，一項(xiàng)研究揭示了E3連接酶中的可降解的激酶和不同的激酶降解圖譜，突顯了連接酶選擇在靶向降解激酶方面的重要性。不同的連接酶降解活性的差異可以受幾個(gè)因素影響。一是連接酶的構(gòu)象和靶點(diǎn)蛋白之間的互補(bǔ)性。二是連接酶與靶點(diǎn)蛋白直接構(gòu)成可導(dǎo)致降解的三元結(jié)構(gòu)的能力。形成三元復(fù)合物是PROTAC分子作用的必要步驟，但三元配合物的形成受底物影響，也就是說，三元復(fù)合物如果過于有效地形成并保持緊密結(jié)合，就不會(huì)導(dǎo)致有效降解。三是連接酶和靶點(diǎn)蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位。四是細(xì)胞特異性連接酶和靶點(diǎn)的表達(dá)。

       因此充分利用尚未在PROTACs中使用的E3連接酶，將有利于PROTACs的發(fā)展，使其具有更多的治療優(yōu)勢。

       然而，可能出現(xiàn)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥是PROTAC分子的一個(gè)局限性。耐藥的產(chǎn)生是由于靶蛋白的點(diǎn)突變導(dǎo)致無法形成三元復(fù)合物而靶蛋白活性增強(qiáng)。對于耐藥性的出現(xiàn)，可以從以下三個(gè)方面考慮。(1)應(yīng)用新的POI配體或新的E3連接酶。含有不同POI配體的PROTAC結(jié)合了一個(gè)新的POI口袋，可以用來減緩耐藥性，例如競爭性和變構(gòu)抑制劑對BCR-ABL的抑制。(2)雙靶向治療。這種protac包含一個(gè)雙靶點(diǎn)彈頭或兩個(gè)彈頭分別靶向兩個(gè)靶點(diǎn)。(3)去泛素酶的抑制作用。去泛素酶從靶蛋白中去除泛素，在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究表明，去泛素酶在耐藥性中起著重要作用。值得注意的是，去泛素酶USP15通過拮抗泛素化防止CRBN介導(dǎo)的底物降解。因此，鑒定和抑制介導(dǎo)PROTACs耐藥的去泛素酶也可能是克服癌癥耐藥和治療反應(yīng)的重要方法。

       綜上，PROTAC技術(shù)具有良好的治療前景，發(fā)展?jié)摿薮?。近兩年，PROTAC標(biāo)桿公司Arvinas正處于臨床關(guān)鍵階段，ARV-110和ARV-471的II/III期臨床結(jié)果會(huì)很大程度上影響PROTAC的發(fā)展策略。在未來的20年里，PROTAC技術(shù)有望在難成藥靶點(diǎn)和全新靶點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)“first-in-class”的突破。