盡管多肽在安全性和選擇性方面具有天然優(yōu)勢，但它的阿喀琉斯之踵（原指阿喀琉斯的腳后跟，因是其身體唯一一處沒有浸泡到冥河水的地方，成為他唯一的弱點(diǎn)。阿喀琉斯后來在特洛伊戰(zhàn)爭中被毒箭射中腳踝而喪命?，F(xiàn)引申為致命的弱點(diǎn)、要害）在于其較差的類藥性，易受酶促降解、腎 臟清除和受體介導(dǎo)的快速清除的影響，從而導(dǎo)致血漿消除半衰期較短。此外，腸胃外給藥的方式給患者帶來不適和不便，這可能會對依從性產(chǎn)生負(fù)面影響，并最終限制治療效果。

       針對多肽在這些方面的缺陷，研究人員開發(fā)了很多相關(guān)技術(shù)進(jìn)行彌補(bǔ)，其中最突出的當(dāng)屬多肽的脂質(zhì)化（lipidation）修飾。Nature Reviews Drug Discovery在最近的一篇文章Derivatization with fatty acids in peptide and protein drug discovery對此進(jìn)行了詳細(xì)的綜述[1]。

       脂肪酸衍生化的基本原理

       生理脂質(zhì)化本身是一種普遍存在且多樣化的翻譯后和共翻譯過程，涉及以不同方式與蛋白質(zhì)連接的各種類型的脂肪酸，從而為蛋白質(zhì)提供獨(dú)特的特性。

       脂肪酸衍生后的皮下注射肽藥物可能在注射部位保留更長時間，因為脂肪酸側(cè)鏈會降低在注射部位的擴(kuò)散速率，得益于脂肪酸與質(zhì)膜和注射部分的白蛋白的結(jié)合（albumin，一種大型多功能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。由于白蛋白含量豐富、半衰期長以及結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸和內(nèi)源性激素的功能，它成為了多肽類藥物的理想載體）。由于白蛋白-多肽復(fù)合物的尺寸較大，注射后組織中的擴(kuò)散速率和毛細(xì)血管壁上的通常會降低[2]。

       除此之外，脂質(zhì)化修飾導(dǎo)致多肽藥物分子疏水性增加，從而加強(qiáng)了分子之間的自締合（self-association），這會降低皮下組織的吸收率，導(dǎo)致通過組織和毛細(xì)血管壁的擴(kuò)散速度變慢[3] 。分子量大于16kDa的蛋白質(zhì)也可以通過淋巴途徑吸收[4]。進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)的脂化多肽，由于與白蛋白之間的可逆、高親和結(jié)合，提高了多肽藥物的藥代動力學(xué)特征，降低大尺寸多肽的腎 臟清除，并降低分配到血管外隔室的速率[5]。

       影響脂質(zhì)化的因素

       1  脂肪酸

       長烷基鏈形式的一元脂肪酸具有一個長碳?xì)滏満鸵粋€端基羧酸基團(tuán)，在一定范圍內(nèi)，其與白蛋白結(jié)合的親和力隨烷基鏈的長度而增加[6]。后來，脂肪二酸類型被引入，提供更強(qiáng)的白蛋白親和力。由于引入了額外的羧酸基團(tuán)，因此可能導(dǎo)致更長的半衰期[7]。白蛋白親和力與脂肪單酸或二酸的長度密切相關(guān)。1,18-十八烷二酸（1,18-Octadecanedioic acid , C18二酸）和 1,20-二十烷二酸（1,20-eicosanedioic acid , C20二酸）是迄今為止測試過的對白蛋白具有最高親和力的脂肪酸（圖1）[8]。

       圖1. C18二酸和C20二酸化學(xué)結(jié)構(gòu)

       脂肪一元酸的疏水性高于脂肪二酸，這會影響衍生分子的溶解度、受體藥理學(xué)和生物物理性質(zhì)。脂肪單酸衍生化將使衍生后的蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜結(jié)合并促進(jìn)內(nèi)吞[9]。相比之下，脂肪二酸具有增加溶解度的未縮合羧基，并且脂肪二酸衍生的肽更不容易與細(xì)胞膜結(jié)合并內(nèi)吞[10]。因此，使用脂肪二酸通?？梢愿玫鼐S持體內(nèi)功效，因為目標(biāo)肽或蛋白質(zhì)不會因與細(xì)胞表面的疏水相互作用而導(dǎo)致丟失或內(nèi)化。連接的脂肪酸類型可能影響受體特異性。肽或蛋白質(zhì)的體外和體內(nèi)功效可能會受到不同程度的影響，具體取決于所連接的是脂肪單酸還是脂肪二酸。

       圖2. C18二酸的四唑和磺酸類似物化學(xué)結(jié)構(gòu)

       脂肪二酸中遠(yuǎn)端游離羧基的最重要效果，在于它賦予了更高的白蛋白結(jié)合親和力，因此具有更長的半衰期。此外據(jù)報道，具有遠(yuǎn)端磺基或四唑基（均為羧酸的電子等排體isostere）的脂肪二酸類似物（圖2），以高親和力與白蛋白結(jié)合并延長肽或蛋白質(zhì)的作用曲線[11]。不過對于某些肽來說，與羧基類型的二酸相比，這些電子等排體似乎沒有增加任何主要優(yōu)勢?？磥碛绊懓椎鞍捉Y(jié)合的深層次原因，還需要進(jìn)一步地研究。

       2 脂質(zhì)化修飾位置

       脂肪酸在蛋白質(zhì)或肽骨架中的位置，對于最 佳效力和半衰期非常重要。尤其是當(dāng)脂肪酸直接修飾到主鏈時（例如通過酰化賴氨酸側(cè)鏈的氨基）。但當(dāng)一個諸如谷氨酸這樣的spacer結(jié)構(gòu)插入脂肪酸和多肽主鏈之間時，多肽主鏈對于與白蛋白的結(jié)合力的影響就有可能會變小。在一項研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪酸衍生的hGH（人生長 激素）與人白蛋白復(fù)合物中的X射線結(jié)構(gòu)顯示了兩個結(jié)合位點(diǎn)，均不涉及肽主鏈[12]。

       除了脂肪酸類型和修飾位點(diǎn)之外，連接脂質(zhì)與多肽的接頭和手臂結(jié)構(gòu)（arm linker）對于衍生后的多肽藥代動力學(xué)特征也有很大的影響，篇幅原因具體內(nèi)容本文不做詳細(xì)介紹。

上市及在研脂化多肽

       最著名的脂化多肽當(dāng)屬司美格魯肽（semaglutide）、利拉魯肽（liraglutide）和替爾泊肽（tirzepatide）了。

       1 司美格魯肽

       圖3. 司美格魯肽（semaglutide）結(jié)構(gòu)式

       司美格魯肽（圖3）是一個GLP-1類似物，是GLP-1受體激動劑多肽，針對2型糖尿病和肥胖癥。司美格魯肽第26位的賴氨酸被硬脂酸二酸（C18 diacid）修飾，增加其與血液白蛋白的結(jié)合，從而延長在血液循環(huán)中的存在時間。在硬脂酸二酸和賴氨酸之間，還存在一個由谷氨酸和2-（2-(2-氨基乙氧基)乙氧基）乙酸二聚物組成的spacer。司美格魯肽在血液中的半衰期約為7 天（165-184小時）[13]。它可以通過每周一次皮下注射（Ozempic®）或每天一次口服給藥（Rybelsus®）。

       2 利拉魯肽

       圖4. 利拉魯肽（Liraglutide）結(jié)構(gòu)式

       利拉魯肽（Liraglutide，Victoza®，Saxenda®）是一種GLP-1類似物，用于治療2 型糖尿病、肥胖癥和預(yù)防與糖尿病相關(guān)的心血管并發(fā)癥。利拉魯肽的Lys26側(cè)鏈偶聯(lián)著一個C-16脂肪酸（亦稱棕櫚酸palmitic acid或軟脂酸），之間通過一個谷氨酸spacer連接（圖4）。這個棕櫚酸修飾，使利拉魯肽能夠與皮下組織和血液中的白蛋白可逆地結(jié)合，并隨時間緩慢釋放。同GLP-1相比，與白蛋白的結(jié)合導(dǎo)致利拉魯肽在腎 臟循環(huán)中的降解減慢和消除減少。

       3 替爾泊肽

       圖5. 替爾泊肽（Tirzepatide）結(jié)構(gòu)式

       替爾泊肽（Tirzepatide，Mounjaro®）是禮來的2型糖尿病多肽藥物，是GLP-1/GIP受體共激動劑，通過皮下注射每周給藥一次。替爾泊肽是人類GIP（glucose-dependent insulinotropic peptide, 葡萄糖依賴性促胰島素多肽）的類似物，附有C20脂肪酸二酸部分，用于優(yōu)化化合物的攝取和代謝[14]。脂肪二酸部分（二十烷二酸）通過谷氨酸和兩個（2-（2-氨基乙氧基）乙氧基）乙酸單元，連接到賴氨酸殘基的側(cè)鏈（圖4）。這個脂質(zhì)化修飾產(chǎn)生了更長的半衰期，并延長劑量之間的時間，替爾泊肽的半衰期約為5天[15]。

       除了利拉魯肽、司美格魯肽和替爾泊肽之外，其它常見的多肽脂質(zhì)化修飾示意圖見下圖。

       圖6. 常見多肽脂質(zhì)化修飾示意圖，來源：Nature Reviews Drug Discovery

       脂肪酸衍生化的機(jī)制

       多肽或蛋白質(zhì)藥物藥代動力學(xué)延長技術(shù)的選擇，取決于預(yù)期的給藥途徑和相關(guān)的消除途徑。脂化技術(shù)在許多情況下可能很有用，因為相對于聚乙二醇衍生，它具有良好的化學(xué)特征。此外，該技術(shù)有可能影響皮下給藥后的吸收率和各種清除途徑的消除率。下圖顯示了各種延長原則和策略。

       圖7. 脂肪酸衍生化能夠延長肽和蛋白質(zhì)藥物半衰期的部分機(jī)制示意圖，來源：Nature Reviews Drug Discovery

       德古胰島素（insulin degludec）是一種用C16脂肪二酸衍生的類似物（圖6），在制劑緩沖液中形成二聚化的六聚體（di-hexamer）。一旦注入皮下組織，二六聚體就形成多聚六聚體（圖7）。

       利拉魯肽和司美格魯肽是胰高血糖素樣肽1（GLP-1）類似物。利拉魯肽的賴氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)了一個C16脂肪單酸（棕櫚酸palmitic acid）; 司美格魯肽的賴氨酸側(cè)鏈接受了一個C18脂肪二酸的修飾（圖6）。利拉魯肽在制劑緩沖液中形成七聚體，一旦注射，利拉魯肽單體就會從七聚體中緩慢解離并與白蛋白結(jié)合。解離的一些利拉魯肽單體，可能通過單酸側(cè)鏈錨定在細(xì)胞膜中（圖7）。

       對于德谷胰島素和利拉魯肽，從皮下組織經(jīng)血液進(jìn)入組織的分布過程中的決速步 （rate-limiting step）是單體的釋放，從而導(dǎo)致觸發(fā)器動力學(xué)（flip-flop kinetics）。在脂肪二酸的促進(jìn)下，司美格魯肽強(qiáng)烈結(jié)合白蛋白，保護(hù)其受蛋白酶降解。在血液中，得到白蛋白蔭護(hù)的司美格魯肽形成了儲庫，其從中緩慢釋放。非白蛋白結(jié)合分子可以通過非受體介導(dǎo)的途徑消除，也可與靶受體結(jié)合以引發(fā)其生物學(xué)作用，然后被消除。如果空間參數(shù)允許的話，多肽-白蛋白復(fù)合體也可以與靶受體結(jié)合，并觸發(fā)生物學(xué)功效（圖7）。

       多肽-白蛋白復(fù)合體也可以通過白蛋白部分與新生兒Fc受體（FcRn）結(jié)合，并以此實現(xiàn)回收再利用，從而進(jìn)一步延長衍生分子的循環(huán)時間（圖7）。

       小   結(jié)

       脂質(zhì)衍生化是一種經(jīng)過臨床驗證的化學(xué)修飾技術(shù)，可用于優(yōu)化多肽和蛋白質(zhì)藥物的藥理特性。該技術(shù)提供了延長天然分子固有的短半衰期的方法，以便能夠每天、每周甚至更長時間地給藥間隔。

       此外，脂肪酸衍生化可用于促進(jìn)生物藥物的口服遞送，并可能改變它們在組織中的分布。多肽脂質(zhì)化安全且有效，它還可以通過各種藥物化學(xué)方法進(jìn)行優(yōu)化，且允許具有成本效益的大規(guī)模生產(chǎn)。總而言之，脂化衍生已成功地應(yīng)用于藥物工程，并且可能在推動多肽藥物開發(fā)中，發(fā)揮越來越重要的作用。

       參考資料：

       [1] Kurtzhals, P. et al. Derivatization with fatty acids in peptide and protein drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 2023, 22, 59–80.

       [2] Gradel, A. K. J. et al. Factors affecting the absorption of subcutaneously administered insulin: effect on variability. J. Diabetes Res. 2018, 1205121.

       [3] Mosekilde, E. et al. Modeling absorption kinetics of subcutaneous injected soluble insulin. J. Pharmacokinet. Biopharm. 1989, 17, 67–87.

       [4] Richter, W. F. et al. Mechanistic determinants of biotherapeutics absorption following SC administration. AAPS J. 2012, 14, 559–570.

       [5] Harris, J. M. et al. Pegylation: a novel process for modifying pharmacokinetics. Clin. Pharmacokinet. 2001, 40, 539–551.

       [6] Spector, A. A. Fatty acid binding to plasma albumin. J. Lipid Res. 1975, 16, 165–179.

       [7] Lau, J. et al. Discovery of the once-weekly glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogue semaglutide. J. Med. Chem. 2015, 58, 7370–7380.

       [8] ®stergaard, S. et al. The effect of fatty diacid acylation of human PYY3–36 on Y2 receptor potency and half-life in minipigs. Sci. Rep. 2021, 11, 21179.

       [9] Nelson, A. R. et al. Myristoyl-based transport of peptides into living cells. Biochemistry. 2007, 46, 14771–14781.

       [10] Gao, X. et al. Fatty acylation enhances the cellular internalization and cytosolic distribution of a cystine-knot peptide. iScience. 2021, 24, 103220.

       [11] Poulsen, C. et al. Rational development of stable PYY3–36 peptide Y2 receptor agonists. Pharm. Res. 2021, 38, 1369–1385.

       [12] Johansson, E. et al. Identification of binding sites on human serum albumin for somapacitan, a long-acting growth hormone derivative. Biochemistry. 2020, 59, 1410–1419.

       [13] Kapitza, C. et al. Semaglutide, a once-weekly human GLP-1 analog, does not reduce the bioavailability of the combined oral contraceptive, ethinylestradiol/levonorgestrel. Journal of Clinical Pharmacology. 2015, 55, 497–504.

       [14] Ahangarpour, M. et al. Photo-induced radical thiol-ene chemistry: a versatile toolbox for peptide-based drug design. Chemical Society Reviews. Royal Society of Chemistry. 2021, 50, 898–944.

       [15] Frias, J. P. Tirzepatide: a glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) dual agonist in development for the treatment of type 2 diabetes. Expert Rev Endocrinol Metab. 2020, 15, 379-394.

       專欄作者

       哥哈骎

       南開大學(xué)本科、碩士，德國比勒菲爾德大學(xué)博士。多肽化學(xué)、多肽API GMP生產(chǎn)專家、歐洲制藥公司首席科學(xué)家；

       擁有Lean Six Sigma黑帶認(rèn)證；

       著有專著《Side Reactions in Peptide Synthesis》。