近日，上海細胞治療集團與中國科學院南海海洋研究所研究員王曉雪團隊合作，共同在微生物工程應用類經(jīng)典期刊Metabolic Engineering上（IF=8.4），發(fā)表了毒素-抗毒素（TA）系統(tǒng)應用方面的最新成果“Minimized antibiotic-free plasmid vector for gene therapy utilizing a new toxin-antitoxin system” (DOI: 10.1016/j.ymben.2023.07.003)。研究以細胞/基因治療臨床需求為導向，開發(fā)了一種利用毒素-抗毒素系統(tǒng)作為克隆篩選標記的小骨架質(zhì)粒載體并命名為太質(zhì)粒（Tiniplasmid）。
以質(zhì)粒為載體的細胞基因治療產(chǎn)品與以病毒為載體的產(chǎn)品相比，在安全性、規(guī)?；糯?、低成本等多方面更具潛力。但質(zhì)粒骨架的大小對真核細胞轉(zhuǎn)基因效率以及細胞毒 性有很大的影響，縮小質(zhì)粒骨架對于提升轉(zhuǎn)基因效率、降低細胞毒 性具有重要意義。綜合毒素殺菌能力以及抗毒素大小的優(yōu)勢，選取了珊瑚共生菌來源的TA系統(tǒng)Rs_0636/Rs_0637作為目標TA系統(tǒng)，成功研發(fā)了最小骨架小于500bp的無抗太質(zhì)粒系統(tǒng)，比1500bp的常規(guī)pUC57質(zhì)粒骨架小1000bp以上。
圖.利用毒素-抗毒素系統(tǒng)Rs_0636/ Rs_0637作為篩選標記在真核轉(zhuǎn)基因表達中的應用
與此同時，作為載體的常規(guī)質(zhì)粒通常采用抗生素抗性基因作為最重要的篩選標記用于DNA克隆、質(zhì)粒發(fā)酵等環(huán)節(jié)，但由于抗生素使用引發(fā)的安全性問題，抗性基因在食品與藥品等領域的使用受到嚴格限制，尤其是在基因治療和DNA疫苗研發(fā)方面。鑒于上述原因，研發(fā)高效且安全的新型篩選系統(tǒng)來取代抗生素抗性基因的使用在臨床研究中顯得尤為重要。TA系統(tǒng)由具有明顯細菌毒 性的毒素以及能夠拮抗其毒 性的抗毒素編碼組成，具有開發(fā)成新型篩選系統(tǒng)的應用潛力。
研究中，王曉雪團隊將攜帶誘導型啟動子的毒素基因整合到工程菌的基因組上，通過誘導毒素來篩選和生產(chǎn)攜帶抗毒素的重組太質(zhì)粒。通過測定不同家族毒素的殺菌活性來評估其作為篩選標記的潛力。研究發(fā)現(xiàn)ParE家族毒素具有明顯的殺菌活性，且其對應的抗毒素能夠通過直接的蛋白-蛋白相互作用來拮抗其細胞毒 性，該TA系統(tǒng)與抗生素系統(tǒng)具有相當?shù)目寺『Y選效率以及DNA質(zhì)粒得率。
在上海細胞治療集團開展的轉(zhuǎn)座子介導的真核細胞轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，與目前商業(yè)化的載體相比，基于該系統(tǒng)開發(fā)的太質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因表達效率方面更具優(yōu)勢，系統(tǒng)安全性評估數(shù)據(jù)也表明該系統(tǒng)在基因治療和DNA疫苗的研發(fā)中具有非常好的應用潛力。
南海海洋研究所博士研究生陳喆為論文的第一作者，副研究員姚建云為論文的共同第一以及共同通訊作者，研究員王曉雪為論文的主要通訊作者。以上研究工作得到了國家自然科學基金項目、上海市浦江計劃、科技基礎資源調(diào)查專項、國家重點研發(fā)計劃等的資助。
上海細胞治療集團就該技術進行了專利申請，具有完全的自主知識產(chǎn)權(quán)。張平靜為專利第一發(fā)明人、劉韜、孫艷、錢其軍為共同作者和發(fā)明人。
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