核酸藥物分類

       核酸藥物主要分為小核酸藥物和mRNA兩大類，小核酸藥物，即寡核苷酸藥物，包括反義核酸(ASO)、小干擾核酸(siRNA)、微小RNA(miRNA)、核酸適配體(Aptamer)及其他。mRNA產(chǎn)品可分為mRNA疫苗和mRNA藥物。

       核酸藥物特點

       核酸藥物擁有明顯優(yōu)勢。傳統(tǒng)的小分子化藥和抗體藥物多是通過與靶點蛋白結合發(fā)揮作用，但兩者的研發(fā)受到靶點蛋白可成藥性的限制，而核酸類藥物是通過與蛋白質表達相關的基因進行調節(jié)，對細胞內外和細胞膜蛋白均可發(fā)揮調節(jié)作用，而且多數(shù)核酸類藥物的作用基礎是堿基互補配對原則，只需知道靶基因的堿基序列，核酸藥物的序列設計就較為容易。

       然而，其不穩(wěn)定性、免疫原性、細胞攝取效率低、內吞體逃逸難等缺陷限制了核酸藥物的發(fā)展，為了解決核酸藥物分子本身相關的挑戰(zhàn)，開發(fā)能夠促進核酸吸收到靶細胞的遞送載體系統(tǒng)成為關鍵。這些遞送載體需要克服細胞外和細胞內的屏障，耐受血液中的核酸酶活性，增強和協(xié)助核酸藥物細胞攝取，并在進入細胞后促進核酸藥物內體逃逸。

       核酸藥物遞送系統(tǒng)

       早期研究多使用病毒作為遞送核酸的載體，臨床實驗使用的病毒載體包括：腺病毒(Ad)、腺相關病毒(AAV)、慢病毒(LV)、單純皰疹病毒(HSV)等。然而，一些病毒載體的不良特性，包括潛在的致癌性、高免疫原性等會導致嚴重的臨床不良事件，影響了對病毒載體臨床應用的研究。隨著材料和制備技術的發(fā)展，價格低廉、易合成、易純化、具有高轉染效率和低免疫原性的非病毒載體成為遞送核酸藥物的“最 佳候選人”。

       GalNac偶聯(lián)修飾

       GalNac(N-乙?；陌肴樘前?偶聯(lián)修飾，是當前最常用的核酸藥物遞送系統(tǒng)， GalNac是一種乳糖類似物通過將GalNac以三價態(tài)的方式共價偶聯(lián)至核酸3‘末端構成。

       GalNac-siRNA偶聯(lián)化合物經(jīng)皮下注射后，能夠迅速通過循環(huán)系統(tǒng)進入肝 臟，之后經(jīng)ASPGR受體介導快速被肝 臟細胞內吞，并在溶酶體中積聚、緩慢釋放，持久不斷地裝載到RNA誘導沉默復合體(RISC)上，從而實現(xiàn)長效抑制作用。

       目前，GalNAc修飾的藥物主要有GalNAc-反義核酸(ASO)與GalNAc-siRNA，由于治療上有效的ASO已經(jīng)是經(jīng)過大量修飾的，因此遞送載體并不是必須的。而siRNA因為其本身容易降解，所以多采用載體遞送技術。目前，利用GalNac技術上市及進入臨床階段的藥物可見表1。

       表1. GalNac技術上市及進入臨床的藥物

       納米顆粒

       1

       脂質納米顆粒

       脂質納米顆粒(Lipid Nanoparticle，LNP)，是脂質載體給藥系統(tǒng)中的重要技術之一。

       主要成分分為以下四種：

         •  可電離的陽離子磷脂為最關鍵的輔料，是遞送和轉染效率的決定性因素，由于其比較容易被抗原呈遞細胞吸收，因此常應用于疫苗；

         •  中性輔助磷脂，一般為飽和磷脂，可提高陽離子脂質體的相變溫度，支持層狀脂質雙層結構的形成并穩(wěn)定其結構排列；

         •  膽固醇，有較強的膜融合性，促進mRNA胞內攝入和胞質進入；

         •  聚乙二醇修飾的磷脂(PEGylated lipid)，位于脂質納米粒表面，改善其親水性，避免被免疫系統(tǒng)快速清除，防止顆粒聚集，增加穩(wěn)定性。

       目前利用LNP技術已有三款上市藥物及十幾款臨床期的藥物，下表列舉了一些代表性的藥物。

       表2. 利用LNP技術上市及臨床的代表藥物

       2

       聚合物納米粒

       陽離子聚合物因其易于合成和靈活的特性，成為非病毒基因遞送載體的另一個主要類型。聚合物可以與核酸結合，在生理pH下形成多聚復合物，以促進基因遞送。通常情況下，聚合物納米顆粒具有帶正電的單元，可促進與核酸的靜電結合。此外，通過使用可降解的連接物，也可實現(xiàn)核酸與聚合物的共價連接。常見的聚合物材料包括聚乙烯亞胺(PEI)、殼聚糖(CS)。

       另一類遞送RNA的聚合物，稱為樹枝狀大分子(dendrimers)。這些大分子以一個核心分子為中心，通過重復增長反應合成具有高度分支的聚合物。攜帶陽離子基團的樹枝狀大分子，可以與RNA生成復合物。已有研究顯示，它們可以將RNA遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，將siRNA遞送到肝 臟內皮細胞中。改造樹枝狀大分子的結構，可以保護核苷酸不被酶降解。

       siG12D-LODER是一種可生物降解的聚合物基質，含有針對KRASG12D的siRNA。目前，諾華正在針對siG12D-LODER進行二期臨床研究，以測試siG12D-LODER與化療藥物(如吉西他濱和紫杉醇)聯(lián)合治療局部晚期胰 腺癌患者的療效。

       3

       無機納米粒

       1、金納米顆粒

       金納米粒子具有獨特的光學特性、合成簡單和表面功能化的特性，可通過共價或非共價綴合與核酸選擇性協(xié)同修飾。核酸鏈通過硫醇基團共價連接到金納米顆粒核心上(通常為13-15 nm)。這一策略可用于DNA和siRNA，它們可以直接連接到金核或聚合物修飾的金核上。

       球形核酸(SNA)是由排列在小球形金納米顆粒表面的核酸組成。目前該平臺藥物NU-0129正在進行一項復發(fā)性膠質瘤的臨床1期的研究。NU-0129穿過血腦屏障一旦進入腫瘤，核酸成分就能夠靶向一種名為Bcl2L12的基因。研究人員認為，用NU-0129靶向Bcl2L12基因，將有助于阻止膠質瘤的生長。

       2、二氧化硅納米顆粒

       二氧化硅納米顆粒(直徑100-250nm)，由于其良好的生物相容性和可調性而被用于核酸遞送。通常，核酸分子通過弱的非共價相互作用，被裝載到二氧化硅納米顆粒中。小孔(2.5-5 nm)的二氧化硅納米顆粒適合于傳遞小的siRNA。

       3、氧化鐵納米顆粒

       氧化鐵納米顆粒(由Fe3O4或Fe2O3組成)具有一定尺寸的超順磁性，作為輸送載體和基于磁熱的療法顯示出了成功的效果。陽離子氧化鐵納米顆粒與陰離子核酸藥物，通過靜電相互結合。50-100nm的脂類包裹的氧化鐵納米顆粒，顯示出最 佳的siRNA遞送活性。

       新型遞送系統(tǒng)

       1

       外泌體

       外泌體是內涵體來源，經(jīng)由多泡體與質膜融合以后釋放到細胞外的，直徑介于50-150nm之間的膜性囊泡狀小體。外泌體內部含有多種生物學大分子，包括蛋白質、核酸和磷脂等。

       外泌體可在細胞間傳輸各種各樣的生物大分子，因此作為一種藥物遞送方式，具有顯著的先天優(yōu)勢：

       首先，外泌體是“天然馴化”的納米載體，本身內含多種有效成分，因此可以適用的負載藥物成分類型非常豐富，包括小分子、核酸和重組蛋白等；

       其次，外泌體是內源性的納米顆粒，免疫源性較低，因此安全性高；

       第三，外泌體可以循環(huán)至人體所有的腔室，具有比較好的組織選擇性；

       最后，可以對外泌體進行復雜的工程化改造，通過基因或者化學等方式，對外泌體的成分以及生物學功能進行調控，從而能夠更好地服務于我們的治療目的。

       表3. 外泌體遞送核酸藥物研究情況

       2

       多肽類

       目前已上市的核酸藥物遞送采用的技術，無法解決特定組織的靶向性問題，多肽可以解決許多其它遞送系統(tǒng)無法解決的問題。非天然氨基酸的化學修飾，極大地提高了多肽藥物在體內的半衰期，環(huán)肽技術發(fā)展增加了多肽結構的剛性、環(huán)肽與靶蛋白接觸面積大增強其親和力，PDC藥物具有強力的腫瘤穿透性、無免疫原性、腎代謝等特點。

       目前，Ionis、Alnylam 、Entrada Therapeutics等公司紛紛建立多肽核酸偶聯(lián)藥物平臺，多肽核酸偶聯(lián)物未來可期。

       3

       其他

       科學大牛張鋒創(chuàng)立的Aera Therapeutics推出了一種名為蛋白納米顆粒(Protein Nanoparticles，PNP)的新型遞送平臺，利用內源性人類蛋白質，解決當前遞送技術的局限。

       專注于RNA療法的生物技術公司Altamira Therapeutics宣布，其正在研發(fā)一種新穎的基于肽的SemaPhore納米顆粒技術平臺。該遞送平臺被設計用于通過全身或局部給藥，可安全有效地將寡核苷酸如siRNA以及mRNA遞送到靶細胞中。目前，該公司基于此平臺已建立了2條在研siRNA項目臨床前管線，用于治療KRAS驅動癌癥和類風濕性關節(jié)炎。

       小結

       核酸療法的研發(fā)經(jīng)歷了漫長的發(fā)展歷程，化學修飾和遞送系統(tǒng)等關鍵技術的突破在核酸療法的產(chǎn)業(yè)化中發(fā)揮了重要的作用。

       通過選擇較好的藥物遞送載體以及采用靶向修飾等策略，超級藥物核酸療法將引領創(chuàng)新藥進入新時代。

       參考文獻：

       1.Kulkarni, J.A. et al. “The Current Landscape of Nucleic Acid Therapeutics.” Nature Nanotechnology, 2021,16(841):630-643.

       2.DebackerAJ, Voutila J, Catley M, Blakey D,Habib N. Delivery of Oligonucleotides to the Liver with GalNAc: From Researchto Registered Therapeutic Drug. Mol Ther. 2020 Aug 5;28(8):1759-1771.

       3.https://clinicaltrials.gov/