推動PROTAC藥物開發(fā)新紀元：擴展PROTAC的E3連接酶

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作者：balabala 來源：藥渡

2023-11-23

靶向蛋白降解(Targeted protein degradation, TPD)作為一種新興的治療策略被廣泛關注，它可以靶向以前被認為“不可成藥”的蛋白質。PROTAC是TPD的主要焦點，它同時招募并結合E3連接酶和靶蛋白(POI)，從而形成E3-降解蛋白POI三元復合物，誘導POI泛素化和隨后的蛋白體降解。

鑒于PROTAC巨大的治療潛力和獨特的機制，該領域引起了學術界和制藥行業(yè)的極大興趣，目前已有250種藥物被PROTACs進行降解測試。盡管PROTAC具有廣泛的治療潛力，但在人類基因組的數(shù)百種E3連接酶中，目前只有不到2%的E3連接酶參與了TPD領域的研究，因此，需要招募更多的E3連接酶來進一步增強TPD的治療潛力。

近日，美國國家癌癥中心的Eytan Ruppin教授和印第安納大學醫(yī)學院生物統(tǒng)計與健康數(shù)據(jù)科學系Leng Han教授團隊研究人員對1075個E3連接酶進行了表征，最終確定了76種有潛力的E3連接酶，擴展了PROTAC的E3連接酶版圖，推動了PROTACs藥物的開發(fā)進展。

研究人員收集了E3連接酶的綜合列表(圖1a)，并利用大規(guī)模數(shù)據(jù)資源、實驗證據(jù)和人工智能(AI)工具來描繪E3連接酶的七個不同的關鍵維度：

化學配位性，表征E3連接酶的粘合劑可用性;

E3連接酶在腫瘤和正常樣本中單細胞水平和整體水平的表達模式;

進一步表征其潛在蛋白靶點的E3連接酶的PPI;

在PROTAC設計中應優(yōu)先考慮的其他重要因素，包括結構可用性、功能必要性、細胞定位和E3連接酶的PPI接口(圖1b)。

之后，他們基于三十個大規(guī)模數(shù)據(jù)集分析，包括3個E3連接酶列表、5個配體庫、5個表達圖譜、7個互作數(shù)據(jù)庫、2個結構數(shù)據(jù)庫、2個重要性篩選、3個細胞定位數(shù)據(jù)庫和3種互作界面數(shù)據(jù)庫，研究人員揭示了幾種有前途的現(xiàn)存的E3連接酶。

圖1. 收集和注釋E3連接酶的示意圖工作流程

PART.

化學配位性

表征E3連接酶的粘合劑可用性

為了尋找可能促進E3連接酶募集的新的藥物，研究人員采用基于深度學習的虛擬篩選配體模型HyperAttentionDTI31，在DrugBank25中搜索E3連接酶與藥物之間潛在的相互作用。

在評估和應用該模型后，研究人員獲得了預測的藥物-靶標相互作用，包括潛在的新型E3連接酶，如Makorin Ring Finger Protein 1 (MKRN1)，與關鍵腫瘤驅動因子TP53和APC32具有ppi，并預測與DB13955(雌二醇二酸酯)和DB03017(月桂酸)相互作用。利用這些藥物可能會增加潛在的新型E3連接酶的配體性，從而靶向其他腫瘤靶點。他們系統(tǒng)分析利用了五個大規(guī)模的數(shù)據(jù)源，并揭示了許多新的E3連接酶和數(shù)十種可用的配體，這些配體可能用于PROTAC的開發(fā)。

PART.

E3連接酶在腫瘤和正常樣本中

單細胞及整體水平的表達模式

通過對腫瘤和正常組織的整合分析，研究人員確定了206個E3連接酶，包括3個增選的和203個新的E3連接酶，它們在TCGA和HPA病理中至少一種腫瘤類型中高表達，而在GTEx和Tabula及大多數(shù)正常組織中低表達。除了這3種被采用的E3連接酶，這203種潛在的新型E3連接酶揭示了一個大型的E3連接酶庫，可用于抗癌PROTAC的開發(fā)。

研究人員全面描繪了大細胞水平和單細胞水平的轉錄組表達，以及E3連接酶的蛋白質組表達，證明了利用大規(guī)模表達數(shù)據(jù)進一步推進PROTAC提高療效和規(guī)避副作用的必要性。

PART.

E3連接酶與POI蛋白

相互作用(PPI)的綜合圖譜

蛋白質被PROTAC降解的可能性因靶蛋白而異，總結E3連接酶相關的ppi應優(yōu)先考慮能被PROTAC高降解的靶蛋白。為了確定這些PROTAC靶點，研究人員將PROTACtable基因組和基于模型的蛋白質降解性分析(MAPD)兩項研究的結果結合起來，對靶點的PROTACtable可降解性進行了評估。這兩項研究突出了3280個PROTAC可處理靶點，其中1025個靶點重疊。

研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些PPIs涉及PROTAC可治療的癌癥靶點，這些靶點尚未在PROTAC中被探索。例如，神經(jīng)母細胞瘤RAS(NRAS)與轉移性結直腸癌的不良預后相關，有證據(jù)表明PPIs具有增選的E3連接酶BIRC2和XIAP，以及潛在的新型E3連接酶CDC20和SKP2。另一個PROTAC可處理的靶點是Rac Family Small GTPase 1 (RAC1)，它誘導乳腺癌的化療耐藥，與增選的E3連接酶MDM2和XIAP以及潛在的新型E3連接酶ITCH和SMURF2相互作用。在開發(fā)針對這些癌癥靶點的PROTACs時，可以考慮相應的E3連接酶。

PART.

E3連接酶的結構可用性、

功能必要性、細胞位置和PPI接口

首先，為了獲得E3連接酶的可用蛋白質結構，研究人員查詢了世界范圍內的結構數(shù)據(jù)庫protein Data Bank (PDB)，鑒定出414個具有實驗確定結構的E3連接酶。這些可用的蛋白質結構，為招募潛在的新E3連接酶提供了很好的機會。

圖2. E3連接信息匯總

然后，研究人員利用依賴圖譜(DepMap)61中的CRISPR和RNAi技術，研究了E3連接酶的遺傳擾動，評估了癌細胞系中基因的必要性。他們在CRISPR篩選中鑒定出146個腫瘤必需的E3連接酶，包括兩個增選的E3連接酶——VHL和RNF4。

緊接著，為了確定E3連接酶的細胞位置，研究人員整合了來自COMPARTMENTS、Gene Ontology (GO)和UniProt的高質量數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)983個E3連接酶被細胞質和/或細胞核注釋，這被認為是PROTAC的首選位置。這些潛在的新型E3連接酶，為實現(xiàn)受限或需要降解的亞細胞定位提供了一種通用的選擇。

最后，研究人員從多種來源收集到跨越928個E3連接酶，包括11個增選的E3連接酶的PPI界面?；诖丝梢灾笇藗兇_定E3連接酶或靶標中觀察到的突變是否位于界面區(qū)域，從而可能進一步破壞E3連接酶與靶標的相互作用。

PART.

局限與展望

然而，此研究目前也有一定的局限性，首先針對E3連接酶的研究主要集中在有限數(shù)量的E3連接酶上，如VHL/CRBN，缺少其他蛋白經(jīng)驗；其次由于目前缺乏大規(guī)模的單細胞蛋白質組學數(shù)據(jù)，無法更高分辨分析E3連接酶的活性，最后翻譯后修飾(PTM)在調節(jié)E3連接酶的活性和豐度（豐度指的是E3連接酶的相對含量）方面也起著關鍵作用。

PTM對PROTAC中E3的調控作用在很大程度上是未知的，大規(guī)模的高分辨率PTM數(shù)據(jù)還無法實現(xiàn)。因此，該網(wǎng)站為用戶提供了根據(jù)他們的偏好選擇數(shù)據(jù)源的選項。除了為PROTAC尋找新的E3連接酶外，E3連接酶的信息也可以被其他TPD領域所利用，如蛋白水解靶向抗體(PROTAB)和分子膠。

總之，該研究通過分析30個大規(guī)模數(shù)據(jù)集，從7個不同的方面系統(tǒng)地表征了E3連接酶，包括化學配體性、表達模式、蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)、結構可用性、功能必要性、細胞位置和PPI接口。揭示了幾種有前途的現(xiàn)存的E3連接酶。綜合置信度評分、配位性、表達模式和PPI，確定了76個E3連接酶作為PROTAC相互作用的候選酶。

此外，盡管新開發(fā)的PROTAC大部分用于癌癥治療，但研究人員對E3連接酶的綜合分析也可以從癌癥轉移到其他領域的治療開發(fā)，例如：治療神經(jīng)和/或免疫疾病。期待E3連接酶能夠持續(xù)助力PROTAC藥物的開發(fā)，造福更多患者！

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