Science子刊：陳正一團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)靶向miRNA的基因編輯療法，治療遺傳性耳聾

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來(lái)源：生物世界

2024-07-12

聽(tīng)力損失是一種多因素疾病，在全世界范圍內(nèi)影響著數(shù)千萬(wàn)人。導(dǎo)致聽(tīng)力損失的單基因突變占所有先天性感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失的 50%以上，然而目前尚無(wú)獲批的藥物或生物療法來(lái)減緩或逆轉(zhuǎn)遺傳性耳聾。

在這些耳聾相關(guān)基因中，miRNA是一類(lèi)短的（約20-24nt）內(nèi)源性非編碼RNA，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)編碼基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是內(nèi)耳發(fā)育的重要因素，也是正常聽(tīng)力所必需的。具體而言，MIR96（miR-96）突變已被確定為人類(lèi)和小鼠常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾50型（DFNA50）的致病因素。

2024年7月10日，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳正一教授團(tuán)隊(duì)在 Science 子刊 Science Translational Medicine 上發(fā)表了題為：Targeted genome editing restores auditory function in adult mice with progressive hearing loss caused by a human microRNA mutation 的研究論文。

該研究?jī)?yōu)化了CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，以特異性清除MIR96突變，使用腺相關(guān)病毒（AAV）將該基因編輯系統(tǒng)遞送至攜帶Mir96^14C＞A突變的成年小鼠耳蝸中，在聽(tīng)力損失癥狀出現(xiàn)前和出現(xiàn)后均可促進(jìn)毛細(xì)胞存活并改善聽(tīng)力。這些結(jié)果表明，靶向編輯miRNA可能是一種保護(hù)DFNA50患者聽(tīng)力的有潛力的新策略。

Targeted genome editing restores auditory function in adult mice with progressive hearing loss caused by a human microRNA mutation 研究論文

MIR96在內(nèi)耳的感覺(jué)細(xì)胞中特異性表達(dá)，通過(guò)降低多個(gè)靶基因的mRNA的表達(dá)，在耳蝸發(fā)育和聽(tīng)力維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MIR96種子區(qū)域的點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)家族中具有顯性遺傳模式的進(jìn)行性聽(tīng)力損失。在小鼠中的研究表明Mir96對(duì)正常毛細(xì)胞發(fā)育是必需的，而Mir96突變之所以導(dǎo)致聽(tīng)力損失，是因?yàn)槠渫蛔兒螽a(chǎn)生了新的靶基因，而不是因?yàn)楣δ軉适?，因此，不能通過(guò)導(dǎo)入正確的Mir96來(lái)進(jìn)行治療。

針對(duì)顯性MIR96突變，基因組編輯技術(shù)顯示出了巨大前景。此前，通過(guò)遞送CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，已在多種聽(tīng)力損失疾病小鼠模型中證明了破壞顯性等位基因的有效性。劉如謙團(tuán)隊(duì)也證實(shí)了堿基編輯可以修復(fù)耳聾小鼠模型的Tmc1基因顯性突變。

在所有關(guān)于遺傳性聽(tīng)力損失的基因編輯研究中，干預(yù)都是在耳蝸未成熟的新生小鼠中進(jìn)行的。相比之下，人類(lèi)新生兒的內(nèi)耳是完全發(fā)育的，小鼠耳蝸從新生到成年階段會(huì)經(jīng)歷發(fā)育變化，包括大小、結(jié)構(gòu)和功能的變化。這種差異突出了需要評(píng)估成熟耳蝸中基因組編輯治療的療效、安全性和時(shí)間窗口，以確定潛在臨床應(yīng)用干預(yù)的可行性。

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)非同源DNA末端連接（NHEJ）進(jìn)行編輯，以在患有聽(tīng)力損失的年輕成年小鼠中靶向顯性Mir96突變（Mir96^tm3.1Wtsi，在該研究中稱(chēng)為 Mir9^614C＞A），通過(guò)腺相關(guān)病毒（AAV）進(jìn)行遞送。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AAV介導(dǎo)的基因編輯復(fù)合物的遞送具有良好的耐受性，且不會(huì)損害正常聽(tīng)力。

研究團(tuán)隊(duì)篩選了不同的基因編輯器，并確定了一個(gè)優(yōu)化的編輯器，從而在體外和體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了高效且特異性的基因編輯。研究團(tuán)隊(duì)在聽(tīng)力損失發(fā)生之前和之后測(cè)試了干預(yù)措施，并確定了治療能使聽(tīng)力持續(xù)保持的時(shí)間窗口。

具體來(lái)說(shuō)，使用AAV2遞送saCas9的KKH變體（SaCas9-KKH）和sgRNA，在聽(tīng)力損失發(fā)生前（3周齡）和聽(tīng)力損失發(fā)生后（6周齡）的成年Mir96^14C>A/+突變小鼠中均長(zhǎng)期改善了聽(tīng)力，在3周時(shí)治療效果更好。

AAV2-SaCas9-KKH-sgRNA4遞送到成年Mir96^14C>A/+小鼠的耳蝸中，可促進(jìn)毛細(xì)胞存活以及維持靜纖毛的完整性

為了提高編輯策略的安全性，研究團(tuán)隊(duì)確定了在未檢測(cè)到AAV整合的劑量范圍，結(jié)果顯示，SaCas9-KKH的瞬時(shí)表達(dá)在注射12周后結(jié)束，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AAV基因組整合的證據(jù)，表明這種體內(nèi)基因組編輯策略的安全性良好。

由于人類(lèi)和小鼠的Mir96在種子區(qū)域的序列100%相同，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種雙AAV系統(tǒng)，攜帶了靶向目前所有已知的人類(lèi)MIR96突變的sgRNA，從而能夠靶向多種MIR96突變，為其潛在的推廣和廣泛應(yīng)用提供了證據(jù)。