二甲基亞砜（DMSO）作為一種關(guān)鍵的極性非質(zhì)子溶劑，在室溫條件下呈透明無(wú)色液態(tài)。它不僅在化學(xué)反應(yīng)中扮演重要角色，也常作為溶劑使用。DMSO的兩親性質(zhì)使其能有效溶解多種小分子疏水性藥物。此外，DMSO還因其卓越的膜滲透性而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和組織的冷凍保護(hù)。DMSO能夠改變細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)DNA質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)攝取，從而可能提升蛋白表達(dá)水平。

       本研究旨在探索DMSO對(duì)HEK-293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的潛在提升作用。研究將確定DMSO的最佳作用濃度和時(shí)間，以期在不引起細(xì)胞毒性的前提下最大化轉(zhuǎn)染效率。需要注意的是，DMSO在活細(xì)胞中的濃度越高或作用時(shí)間越長(zhǎng)，其細(xì)胞毒性可能越大，因?yàn)镈MSO可能降低細(xì)胞膜的剛性，高濃度下甚至可能誘導(dǎo)膜孔的形成。HEK-293細(xì)胞系是一種廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)的細(xì)胞系，其轉(zhuǎn)染效率高，翻譯后修飾正確，且蛋白表達(dá)速度快，通常在48小時(shí)內(nèi)達(dá)到高峰。對(duì)于需要在單細(xì)胞水平研究膜蛋白的科研人員來(lái)說(shuō)，提高HEK-293細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)效率尤為關(guān)鍵。

       本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了DMSO處理對(duì)HEK-293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)量的影響。研究團(tuán)隊(duì)采用GFP作為報(bào)告蛋白，通過(guò)測(cè)定表達(dá)GFP的細(xì)胞百分比來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，并監(jiān)測(cè)DMSO對(duì)細(xì)胞可能造成的潛在損害。最終，研究選用了磷酸鈣法進(jìn)行HEK-293細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。盡管市場(chǎng)上有許多基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑，磷酸鈣法依然是一種簡(jiǎn)便、高效且成本低廉的轉(zhuǎn)染手段，適用于多種貼壁和懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染工作。

       結(jié)果

       DMSO的作用

       為了探究DMSO對(duì)HEK-293細(xì)胞中重組蛋白短暫表達(dá)的影響，研究團(tuán)隊(duì)首先進(jìn)行了GFP的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。與未處理的對(duì)照組相比（見(jiàn)圖1A右側(cè)），在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后4小時(shí)加入DMSO至培養(yǎng)基中，似乎能夠提升GFP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量（見(jiàn)圖1B右側(cè)）。實(shí)驗(yàn)圖像顯示，與未經(jīng)DMSO處理的培養(yǎng)皿相比，經(jīng)過(guò)DMSO處理的培養(yǎng)皿中觀察到更多或更亮的GFP陽(yáng)性細(xì)胞（見(jiàn)圖1C及其說(shuō)明）。

       在轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒后的4小時(shí)內(nèi)，研究者將DMSO加入到細(xì)胞培養(yǎng)中。常規(guī)操作中，轉(zhuǎn)染液被添加到細(xì)胞上，隨后培養(yǎng)皿被放回37℃的培養(yǎng)箱中。4小時(shí)后，轉(zhuǎn)染液被常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換。研究者嘗試將DMSO與轉(zhuǎn)染液預(yù)先混合后加入細(xì)胞，但發(fā)現(xiàn)這樣做會(huì)導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)量顯著減少，這可能是由于DMSO與細(xì)胞共孵育4小時(shí)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，將DMSO與轉(zhuǎn)染液混合會(huì)在混合物中形成沉淀。

       因此，研究者決定在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后等待4小時(shí)再進(jìn)行DMSO處理。也就是說(shuō)，在轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，研究者取出轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)皿，首先用PBS進(jìn)行洗滌，然后進(jìn)行DMSO處理。DMSO處理結(jié)束后，再次用PBS洗滌培養(yǎng)皿，并在放回培養(yǎng)箱前補(bǔ)充完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。這一調(diào)整后的步驟有助于避免DMSO可能引起的細(xì)胞毒性，同時(shí)保持了轉(zhuǎn)染效率。

圖1:DMSO對(duì)HEK-293T細(xì)胞中GFP瞬轉(zhuǎn)表達(dá)的影響

       最佳DMSO濃度和賦予時(shí)間的研究

       隨后，研究者著手探究用于轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞的DMSO處理的最佳濃度和時(shí)間。這一點(diǎn)至關(guān)重要，因?yàn)镈MSO在較高濃度或長(zhǎng)時(shí)間作用下可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害。眾所周知，DMSO即使在較低濃度下，長(zhǎng)時(shí)間接觸也可能帶來(lái)細(xì)胞毒性。為了找到最合適的DMSO濃度，研究者在PBS中對(duì)4種不同濃度的DMSO進(jìn)行了測(cè)試，這些濃度分別是5%、10%、15%和20%（體積比%；見(jiàn)圖2），處理時(shí)間為5分鐘，同時(shí)設(shè)有對(duì)照組，即未經(jīng)DMSO處理，僅用PBS緩沖液處理的培養(yǎng)皿。根據(jù)圖2A的結(jié)果，10%的DMSO處理能夠帶來(lái)更高比例的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。與此相對(duì)，5% DMSO并未相較于對(duì)照組顯著增加GFP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。而更高濃度的DMSO處理則導(dǎo)致GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著下降。在10% DMSO濃度下，研究者還觀察到亮度最高的GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比最高。

       在確定了10%為最佳DMSO濃度后，研究者接著測(cè)試了不同的處理時(shí)間，從2分鐘到15分鐘不等，以10% DMSO溶液在室溫下孵育細(xì)胞。結(jié)果顯示，大約5分鐘的孵育時(shí)間最為理想（見(jiàn)圖2B）。與對(duì)照組相比，較短的孵育時(shí)間（如2分鐘）對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響不大。而當(dāng)DMSO孵育時(shí)間超過(guò)5分鐘后，GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量有所下降。綜合圖1和圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者得出結(jié)論，10% DMSO溶液對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行5分鐘的孵育是最佳方案。

圖2：確定DMSO的最佳濃度和孵育時(shí)間

       DMSO孵育后GFP表達(dá)隨時(shí)間的變化

       接著，研究者對(duì)經(jīng)DMSO處理的培養(yǎng)皿中GFP表達(dá)水平隨時(shí)間的變化進(jìn)行了追蹤觀察。具體而言，他們對(duì)DMSO處理組和對(duì)照組（未處理）培養(yǎng)皿中6天內(nèi)表達(dá)GFP的細(xì)胞百分比進(jìn)行了測(cè)定。研究結(jié)果顯示，在觀察期間，DMSO處理組的GFP表達(dá)始終高于未處理組（對(duì)照組見(jiàn)圖3B，處理組見(jiàn)圖3A）。此外，兩組細(xì)胞在培養(yǎng)第2天均達(dá)到GFP表達(dá)的峰值（見(jiàn)圖3C）。通過(guò)分析第2天的數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后4小時(shí)采用5% DMSO進(jìn)行5分鐘處理的培養(yǎng)皿中，表達(dá)GFP的細(xì)胞平均增加了約1.6倍。

       從第3天起，兩組細(xì)胞培養(yǎng)液的總體熒光強(qiáng)度開(kāi)始逐步下降（見(jiàn)圖3C）。研究者還發(fā)現(xiàn)，在33℃的較低溫度下培養(yǎng)細(xì)胞，與37℃標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溫度相比，低溫環(huán)境有助于保持更多的細(xì)胞存活。實(shí)際上，未處理的細(xì)胞在第2天后也表現(xiàn)出類(lèi)似的下降趨勢(shì)（見(jiàn)圖3C），這與研究者之前對(duì)常規(guī)HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)條件（無(wú)DMSO處理）的觀察相符，進(jìn)一步證實(shí)了短時(shí)間DMSO孵育（5分鐘）對(duì)轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞狀態(tài)的影響微乎其微。

       綜合分析，從第2天起綠色細(xì)胞百分比的下降可能主要是由于蛋白質(zhì)的內(nèi)在降解和/或細(xì)胞的裂解。有研究指出，GFP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期大約為26小時(shí)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如HEK-293細(xì)胞）中進(jìn)行重組蛋白的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，通常選擇在轉(zhuǎn)染后24至72小時(shí)內(nèi)收集細(xì)胞，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)間段內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)量最高。研究者所觀察到的現(xiàn)象（見(jiàn)圖3）正符合這一時(shí)間窗口。

圖3：DMSO孵育后GFP表達(dá)的時(shí)間過(guò)程

       結(jié)論

       短暫轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)重組蛋白的生產(chǎn)力取決于多種因素。這些因素包括宿主細(xì)胞類(lèi)型、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯速率、基因表達(dá)的穩(wěn)定性、細(xì)胞中的翻譯后修飾以及轉(zhuǎn)染效率。一旦選擇了細(xì)胞來(lái)源或細(xì)胞系，操縱轉(zhuǎn)染效率可能是提高基因產(chǎn)物產(chǎn)量最有效的方法之一。使HEK-293細(xì)胞成為短暫基因表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)吸引人的選擇的各種屬性之一是這些細(xì)胞可以很容易地被操縱?；谶@一理念，我們研究了，并在這里報(bào)告，短暫暴露DMSO對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生產(chǎn)力對(duì)短暫表達(dá)產(chǎn)量的影響。正如我們?cè)谶@項(xiàng)研究中所展示的，將10% DMSO暴露于4小時(shí)后轉(zhuǎn)染感興趣重組蛋白的HEK-293細(xì)胞，可以提高表達(dá)產(chǎn)量約1.6倍，而對(duì)細(xì)胞的活性或生長(zhǎng)沒(méi)有任何負(fù)面影響。

       我們研究中的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，DMSO對(duì)細(xì)胞的暴露應(yīng)該在細(xì)胞已經(jīng)暴露于轉(zhuǎn)染試劑后4小時(shí)發(fā)生；在我們的例子中，我們使用了鈣磷酸鹽DNA共沉淀。在這種情況下，認(rèn)為與細(xì)胞的轉(zhuǎn)染混合物4小時(shí)孵化足以允許吸收細(xì)胞表面的外來(lái)DNA。這是我們通常會(huì)用完整培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染溶液，然后將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物放回孵化器的時(shí)間。因此，用DMSO處理培養(yǎng)物5分鐘只是完整培養(yǎng)基交換之前的一個(gè)額外步驟。然而，應(yīng)注意，在DMSO處理后進(jìn)行培養(yǎng)基替換期間，因?yàn)榻?jīng)過(guò)DMSO處理的細(xì)胞容易在培養(yǎng)基交換時(shí)被沖走。如果一個(gè)人希望收獲整個(gè)培養(yǎng)物而不僅僅是使用一小部分細(xì)胞進(jìn)行電生理學(xué)研究，這一點(diǎn)將特別重要。關(guān)于這一點(diǎn)，我們還最初嘗試使用相同的協(xié)議，即5分鐘10% DMSO處理，使用懸浮適應(yīng)的HEK-293S細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)在HEK-293S細(xì)胞中也有類(lèi)似的增強(qiáng)，但是培養(yǎng)皿必須首先涂覆膠原蛋白；否則在去除DMSO溶液并清洗培養(yǎng)皿之前，會(huì)有大量的細(xì)胞丟失。顯然，通過(guò)移液管將DMSO溶液從培養(yǎng)皿中分離出來(lái)是適合靜態(tài)培養(yǎng)的?？偟膩?lái)說(shuō)，我們描述的方法很容易實(shí)施，考慮到鈣磷酸鹽DNA共沉淀協(xié)議是將外來(lái)基因引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的方式。實(shí)際上，自從Graham和Van der Eb在1973年報(bào)道這種方法用于轉(zhuǎn)染腺病毒DNA和猴病毒40進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞以來(lái)，鈣磷酸鹽轉(zhuǎn)染一直是引入基因的流行的方法之一。

       對(duì)轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞使用10% DMSO進(jìn)行5分鐘處理，由此增加了約1.6倍的轉(zhuǎn)染效率，這一效果很可能歸因于DMSO分子提高膜滲透性的能力，通過(guò)滲透作用以及DMSO誘導(dǎo)的膜上磷脂頭基的脫水作用。因此，更多的cDNA質(zhì)粒能夠進(jìn)入細(xì)胞，或者通過(guò)內(nèi)吞作用準(zhǔn)確地被細(xì)胞攝取，并最終進(jìn)入細(xì)胞核。然而，更高濃度的DMSO或更長(zhǎng)時(shí)間的DMSO暴露具有細(xì)胞毒性。即使是較低濃度的DMSO，但長(zhǎng)時(shí)間暴露或極端情況下，長(zhǎng)期將DMSO培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，也可能對(duì)細(xì)胞造成傷害。在這項(xiàng)研究中，我們展示了盡管將同一DMSO濃度（即10%）的暴露時(shí)間從5分鐘延長(zhǎng)到10分鐘，并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，至少不會(huì)顯著降低，但它確實(shí)導(dǎo)致了蛋白表達(dá)百分比的降低，正如GFP實(shí)驗(yàn)中所見(jiàn)。在這種情況下，蛋白質(zhì)產(chǎn)量的減少，而不是細(xì)胞數(shù)量，可能歸因于DMSO處理對(duì)轉(zhuǎn)錄的負(fù)面影響。DMSO的過(guò)度暴露可能會(huì)抑制細(xì)胞核糖體的功能。只要將暴露時(shí)間保持簡(jiǎn)短或精確地5分鐘，這樣的程序就可以在不損害細(xì)胞活性、細(xì)胞生長(zhǎng)或在HEK-293細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能屬性的情況下，產(chǎn)生更高的短暫轉(zhuǎn)染產(chǎn)量。