2025年1月13日，中國科學院生物物理研究所趙巖團隊在 Nature 子刊 Nature Structural & Molecular Biology 發(fā)表了題為：Binding mechanism and antagonism of the vesicular acetylcholine transporter VAChT 的最新研究成果。
該研究通過冷凍電鏡單顆粒技術重構出人類囊泡乙酰膽堿轉運體（VAChT）在無底物狀態(tài)下、底物ACh結合狀態(tài)下以及抑制劑vesamicol結合狀態(tài)下的高分辨率結構，闡明了VAChT底物識別和質子耦合轉運過程機制，其抑制劑vesamicol結合結構揭示了vesamicol與VAChT的抑制機制，為設計靶向VAChT的新型示蹤劑提供了結構基礎。
一個神經(jīng)元的放電（firing）就像一個火花，點亮了紛繁復雜的神經(jīng)通路，傳遞著記憶和行動等指令，高效協(xié)調神經(jīng)系統(tǒng)各項功能，從而精準調控我們的想法、情感和動作，構建起一個精細有序的 “神經(jīng)網(wǎng)絡世界”。
回溯近一百年神經(jīng)科學探索，“蛙心灌流”實驗意義非凡。借助蛙心跳動，科學家首次揭示了神經(jīng)沖動與化學傳遞的關系。作為人類發(fā)現(xiàn)的第一種神經(jīng)遞質，隨著對乙酰膽堿研究的不斷深入，其生理功能正逐漸變得清晰起來：在外周神經(jīng)系統(tǒng)中控制肌肉運動；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中影響思維、認知和記憶。同時，膽堿能神經(jīng)元功能異常與多種疾病密切相關。
以肌無力綜合癥為例，膽堿能神經(jīng)元或其下游肌肉的運作障礙將逐漸侵蝕患者的日常生活能力：從表情僵硬、吞咽困難，到四肢動作受限，最終步態(tài)變得遲緩甚至完全喪失行走能力。在病程后期，由于呼吸肌無力或心臟等關鍵器官功能的衰竭，生命因此受到威脅。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，膽堿能神經(jīng)元則承擔著認知和記憶的重要功能。當這些神經(jīng)元發(fā)生異?；蛑饾u丟失，患者逐漸經(jīng)歷智力衰退、語言障礙和感知力減弱。阿爾茨海默癥、帕金森綜合征的發(fā)生也與膽堿能神經(jīng)元的減少密切相關。這些不僅凸顯了膽堿能神經(jīng)信號傳遞在生理、病理中扮演者關鍵角色，也是相關疾病的診療關鍵。
“星星之火，可以燎原”，神經(jīng)元的放電需要“火種”的點燃。乙酰膽堿猶如一根根“火柴”，點燃了神經(jīng)與神經(jīng)，神經(jīng)與肌肉之間的信號傳遞，驅動思維與肢體精準協(xié)作。乙酰膽堿在突觸間隙完成了信號傳遞過程之后，被乙酰膽堿酯酶分解為“火柴棍”乙酸和“火柴頭”膽堿。“火柴頭”膽堿是生產乙酰膽堿的“戰(zhàn)略”物資，在高親和力膽堿轉運體（CHT1）的嚴格篩查下運輸送往乙酰膽堿生產線（見圖1）——那么，關于這樣的篩查和運輸是如何進行的？
2024年，中國科學院生物物理研究所趙巖課題組先后在 Nature Structural & Molecular Biology、Structure 期刊發(fā)表系統(tǒng)性研究，揭示了CHT1偶聯(lián)鈉離子、氯離子攝取膽堿的分子機制，以及與小分子抑制劑的識別機制，為深層次的理解膽堿是如何被攝取進膽堿能神經(jīng)元提供了全面的見解。
利用CHT1攝取的膽堿，膽堿能神經(jīng)元中由膽堿乙酰轉移酶合成新的“火柴”乙酰膽堿。隨后，乙酰膽堿會被送往一個個囊泡儲存，為驅動下一次信號傳遞做準備。那么，這個關鍵環(huán)節(jié)是如何發(fā)生的呢？
囊泡乙酰膽堿轉運體（VAChT）作為一種至關重要的轉運蛋白，猶如一名技術嫻熟的“打包員”，將乙酰膽堿打包進入囊泡（見圖1）。
幾十年來，研究人員對VAChT已進行了廣泛研究，但其選擇性轉運乙酰膽堿的分子機制仍未被完全闡明。此外，膽堿能神經(jīng)元在腦內的豐度變化與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進展密切相關。由于VAChT是膽堿能神經(jīng)元標志性蛋白質分子，通過開發(fā)靶向VAChT的分子影像技術（包括PET和SPECT等）示蹤劑是相關神經(jīng)退行性疾病的早期診斷關鍵策略。目前，部分靶向VAChT的示蹤劑已進入臨床II期試驗。然而，這些示蹤劑與VAChT之間的相互作用機制仍未完全明確。
圖1. 膽堿能神經(jīng)元中乙酰膽堿的循環(huán)及信號傳遞過程
VAChT屬于質子/溶質逆向轉運蛋白家族，在質子電化學勢的驅動下完成底物乙酰膽堿的跨膜轉運。研究團隊分別解析無底物及乙酰膽堿結合的囊泡開口結構（見圖2c），同時鑒定出獨特的質子傳遞網(wǎng)絡。乙酰膽堿結合在VAChT中央口袋中，通過與結合口袋周圍關鍵氨基酸形成大量氫鍵和靜電相互作用，從而實現(xiàn)特異性的結合與轉運。
為了深入理解這些相互作用對轉運功能的影響，研究團隊將與乙酰膽堿及質子結合密切相關的關鍵氨基酸進行了突變，并在小鼠大腦背側紋狀體內對膽堿能神經(jīng)元釋放乙酰膽堿的功能進行了研究（見圖2a）。紋狀體內乙酰膽堿的釋放對包括運動控制、決策行為、學習和記憶在內的多種生理功能具有重要調節(jié)作用。我們發(fā)現(xiàn)相關的突變會直接影響乙酰膽堿在紋狀體中的釋放，直觀地闡釋了質子結合、底物轉運與生理功能之間的關系，為理解VAChT在乙酰膽堿轉運、儲存和釋放中的作用提供了重要見解。
Vesamicol 是特異性結合VAChT的高親和力抑制劑，可以有效的阻斷其轉運活性。Vesamicol的衍生物，如[123I]iodobenzovesamicol（[123I]IBVM）和[18F]fluoroethoxybenzovesamicol（[18F]FEOBV），都已進入臨床二期階段，用于檢測膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的數(shù)量和完整性，為神經(jīng)退行性疾病的診斷提供關鍵信息。
為了探究vesamicol結合VAChT的機制，研究團隊成功解析了vesamicol與VAChT結合復合物的高分辨率結構（見圖2c），vesamicol通過與VAChT的特定結合位點相互作用結合在囊泡側開口的口袋中，穩(wěn)定轉運蛋白在特定構象中，阻止VAChT從囊泡開口構象轉變?yōu)榘|側開口構象，進而抑制乙酰膽堿的轉運。此外，通過放射性抑制劑結合實驗，進一步驗證了參與相互作用和選擇性抑制的關鍵氨基酸（見圖2b）?？傊@項研究加深了對VAChT底物識別和獨特質子偶聯(lián)底物轉運機制的認識，為神經(jīng)退行性疾病的示蹤劑開發(fā)與優(yōu)化奠定了重要基礎。
圖2：小鼠大腦紋狀體VAChT介導乙酰膽堿囊泡填充的動態(tài)檢測、抑制劑vesamicol特異性結合曲線及VAChT在天然狀態(tài)、底物乙酰膽堿結合狀態(tài)以及抑制劑vesamicol結合狀態(tài)下的冷凍電鏡結構
中國科學院生物物理研究所趙巖研究員為該論文通訊作者，中國科學院生物物理研究所博士研究生馬喬、中國科學院深圳先進技術研究院助理研究員馬錕鵬、北京林業(yè)大學副教授董艷麗、博士研究生孟宇飛和北京大學現(xiàn)代農業(yè)研究院趙珺研究員為論文共同第一作者。此外，實驗室成員黎仁杰、白秦儒，中國科學院物理研究所姜道華研究員、博士研究生武迪和中國科學院深圳先進技術研究院孫堅原研究員也為本研究做出了重要貢獻。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41594-024-01462-9
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