摘要：

在生物醫(yī)藥研究、診斷和不同療法中使用的重組蛋白大多是在制藥工業(yè)中的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中生產(chǎn)的。這些生物治療藥物，特別是單克隆抗體，在過(guò)去幾十年中顯示出顯著的市場(chǎng)增長(zhǎng)。對(duì)大量生物制劑日益增長(zhǎng)的需求要求不斷優(yōu)化和改進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)。研究旨在發(fā)現(xiàn)更好的手段和方法以達(dá)到更高的體積容量，同時(shí)保持穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量。越來(lái)越多的復(fù)雜新型蛋白治療藥物，如病毒抗原、疫苗、雙特異性和三特異性單克隆抗體，目前正進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)管線。這些生物分子在許多情況下難以表達(dá)，需要針對(duì)產(chǎn)品特定的解決方案來(lái)改善它們的瞬時(shí)或穩(wěn)定生產(chǎn)。所有這些要求推動(dòng)了更高效表達(dá)優(yōu)化系統(tǒng)和高通量篩選平臺(tái)的發(fā)展，以促進(jìn)產(chǎn)品特定的細(xì)胞系工程和生產(chǎn)策略的設(shè)計(jì)。在這篇簡(jiǎn)評(píng)中，我們提供了關(guān)于CHO細(xì)胞系開(kāi)發(fā)、靶向基因操作技術(shù)、選擇系統(tǒng)和目前在重組蛋白生產(chǎn)中使用的篩選方法的最新進(jìn)展的概述。

1.介紹

生物治療藥物和診斷（治療診斷學(xué)）是制藥市場(chǎng)中迅速增長(zhǎng)的產(chǎn)品。它們包括各種單克隆抗體（mAbs）、疫苗、激素和其他蛋白質(zhì)，所有這些都有廣泛的應(yīng)用。自2002年以來(lái)，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)了300多種生物制藥，并且這一數(shù)字還在增長(zhǎng)，因?yàn)樯镏苿ǖ鞍踪|(zhì)、核酸、糖及其復(fù)合物）正在進(jìn)入診斷和治療的越來(lái)越多的領(lǐng)域。滿足這些產(chǎn)品日益增長(zhǎng)的需求仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，并推動(dòng)了制造過(guò)程中的不斷創(chuàng)新。策略旨在優(yōu)化蛋白質(zhì)表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)更高的體積生產(chǎn)率，同時(shí)保持穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量和較低的制造成本，并縮短時(shí)間?？捎玫纳镏苿┲泻艽笠徊糠质侵亟M蛋白，其中大多數(shù)是在哺乳動(dòng)物表達(dá)平臺(tái)中生產(chǎn)的。在這篇綜述中，我們專注于這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，盡管還有其他系統(tǒng)可用于生產(chǎn)活性重組蛋白，并正在評(píng)估其在制藥工業(yè)中的潛在應(yīng)用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞傾向于成為工業(yè)生物制藥生產(chǎn)的主導(dǎo)宿主，主要是因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生多樣化、正確折疊和糖基化的蛋白質(zhì)。在過(guò)去十年中，翻譯后修飾的重要性，特別是糖基化，以及它們?nèi)绾斡绊懼亟M蛋白的不同屬性的問(wèn)題，引起了廣泛關(guān)注。廣泛的研究導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)，為了潛在的治療用途，大型和復(fù)雜的蛋白質(zhì)需要具有類(lèi)似人類(lèi)的翻譯后修飾，才能具有功能性和非免疫原性。不同小組的幾項(xiàng)研究表明，適當(dāng)?shù)奶腔喞龠M(jìn)生物活性和穩(wěn)定性，增加半衰期并減少蛋白質(zhì)治療藥物的免疫原性。

2.用于制藥重組蛋白表達(dá)的CHO表達(dá)平臺(tái)

基于哺乳動(dòng)物表達(dá)的系統(tǒng)涉及各種不同來(lái)源的細(xì)胞系，包括倉(cāng)鼠（CHO, BHK）、人類(lèi)（HEK293, HT-1080, PER.C6, CAP, HKB-11, Huh-7）和小鼠（NS0, Sp2/0）。然而，70%的生物制劑，幾乎所有的單克隆抗體，都是在倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞中生產(chǎn)的，作為生物制藥蛋白生產(chǎn)的最常用和首選宿主。它們的流行在于它們能夠高生產(chǎn)率（批培養(yǎng)中0.1–1 g/L，在補(bǔ)料批培養(yǎng)中1–10 g/L），表現(xiàn)出一致的良好生長(zhǎng)表型，適合大規(guī)模工業(yè)培養(yǎng)，可以輕松適應(yīng)各種化學(xué)定義的培養(yǎng)基，對(duì)人類(lèi)病毒的感染不太敏感，并且能夠進(jìn)行與人類(lèi)兼容的糖基化。CHO ori細(xì)胞系是由Theodore Puck在1956年分離和永生化的。然后通過(guò)引入突變或適應(yīng)不同的培養(yǎng)條件進(jìn)一步開(kāi)發(fā)亞克隆。與親本細(xì)胞系相比，CHO ori衍生的細(xì)胞系具有特定的屬性，更有利于高效蛋白質(zhì)生產(chǎn)或生產(chǎn)者細(xì)胞系的建立。CHO DXB11 (dhfr+/), CHO DG44 (dhfr/) 和 CHO-GS-/- (CHO-K1SV)宿主已經(jīng)生成，通過(guò)利用代謝標(biāo)記，即二氫葉酸還原酶介導(dǎo)的甲氨蝶呤（MTX）基礎(chǔ)和谷氨酰胺合成酶介導(dǎo)的甲硫氨酸亞砜胺（MSX）基礎(chǔ)選擇系統(tǒng)，使克隆選擇更容易和更快。同時(shí)，MTX選擇也作為一種基因擴(kuò)增系統(tǒng)，允許高產(chǎn)品產(chǎn)量。CHO-S及其衍生細(xì)胞系已經(jīng)適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，目的是通過(guò)增加生產(chǎn)者細(xì)胞密度來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的體積生產(chǎn)。盡管共享相同的共同祖先，不同的CHO譜系由于廣泛的誘變和克隆選擇表現(xiàn)出顯著的遺傳異質(zhì)性。這些遺傳差異，也影響核型和表觀遺傳變異，解釋了最廣泛使用的CHO細(xì)胞系（主要是CHO-K1, CHO DXB11, CHO-S和CHO DG44）之間的宿主細(xì)胞特異性差異。因此，CHO表達(dá)平臺(tái)為宿主細(xì)胞選擇和蛋白質(zhì)生產(chǎn)優(yōu)化提供了廣泛的選擇。不同小組的比較研究提供了大量關(guān)于不同重組CHO細(xì)胞系對(duì)各種生物制劑的細(xì)胞特異性生長(zhǎng)和產(chǎn)品形成的數(shù)據(jù)。在一個(gè)代表性例子中，Reinhart等人已經(jīng)表明，CHO-K1細(xì)胞更傾向于細(xì)胞特異性生產(chǎn)力（7–16 pg/cell/day），而CHO-S更傾向于生物質(zhì)生產(chǎn)，但單克隆抗體表達(dá)較低（2–6 pg/cell/day），這與CHO DG44細(xì)胞相似（在相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中為2–4 pg/cell/day）。該小組還研究了CHO宿主對(duì)不同培養(yǎng)條件（批培養(yǎng)、補(bǔ)料批培養(yǎng)、半連續(xù)灌注培養(yǎng)）和化學(xué)定義培養(yǎng)基的偏好。研究得出結(jié)論，觀察到的表達(dá)差異與宿主細(xì)胞特異性表型和代謝有關(guān)，并與培養(yǎng)方法或細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基沒(méi)有很強(qiáng)的相關(guān)性。

3.CHO細(xì)胞系優(yōu)化——歷史視角

數(shù)十年來(lái)，世界各地的研究團(tuán)隊(duì)都投入了巨大努力，試圖提高生產(chǎn)者CHO細(xì)胞系的性能。這些細(xì)胞系操作的嘗試旨在實(shí)現(xiàn)更高的生產(chǎn)力和產(chǎn)品產(chǎn)量，并利用了關(guān)于轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞代謝、信號(hào)通路和分泌機(jī)制的現(xiàn)有知識(shí)。宿主細(xì)胞工程的主要策略是基于過(guò)表達(dá)有利于細(xì)胞增殖、長(zhǎng)壽、應(yīng)激和凋亡抵抗、蛋白質(zhì)生產(chǎn)和分泌的基因。眾多研究表明，瞬時(shí)或穩(wěn)定過(guò)表達(dá)參與細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)生物合成和糖基化的關(guān)鍵基因可分別提高生長(zhǎng)速率、生產(chǎn)力，并獲得更好的產(chǎn)品質(zhì)量。通過(guò)過(guò)表達(dá)各種轉(zhuǎn)錄因子、抗凋亡（例如BCL2、XIAP、AVEN、MCL1）和促增殖基因，也已證明細(xì)胞活力和培養(yǎng)性能得到改善。蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步也為宿主細(xì)胞的合理工程做出了貢獻(xiàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析被用來(lái)識(shí)別基因操作的潛在靶點(diǎn)，以提高產(chǎn)品產(chǎn)量，如谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞單位的報(bào)道。與有益基因的強(qiáng)制表達(dá)相反，其他細(xì)胞系優(yōu)化方法側(cè)重于通過(guò)基因組敲除或通過(guò)RNAi介導(dǎo)的基因沉默來(lái)消除或抑制“不利”基因。破壞基因功能或消除基因產(chǎn)物有不同方式：i）通過(guò)靶向基因組操作部分或完全刪除特定基因，ii）通過(guò)突變“關(guān)閉”基因功能，iii）siRNA介導(dǎo)的基因沉默。微RNA（miRNA），已知在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，在過(guò)去十年中也已深入研究其在CHO細(xì)胞工程中的潛力。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA對(duì)諸如轉(zhuǎn)錄、翻譯、核糖體生物合成、分泌、細(xì)胞周期、代謝和細(xì)胞死亡等多個(gè)細(xì)胞功能有影響。因此，利用miRNA調(diào)控系統(tǒng)代表了一種高效分子工具，可用于整個(gè)細(xì)胞途徑的工程。miRNA過(guò)表達(dá)（例如miR-2861、miR-23、miR-17）或通過(guò)抗miRNA、病毒載體、海綿和tough decoy載體（例如miR-7、miR-106b、miR-14等許多其他）敲低，已在CHO細(xì)胞系優(yōu)化中成功使用，以使細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境、溫度變化并增強(qiáng)蛋白質(zhì)生產(chǎn)。最近一項(xiàng)研究報(bào)道了使用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)刪除miR-744，目的是提高CHO生物過(guò)程性能。操縱miRNA介導(dǎo)的調(diào)控也已應(yīng)用于提高人工設(shè)計(jì)的難以表達(dá)的新生物治療劑的生產(chǎn)。歷史上，基因消減研究針對(duì)的是代謝（例如LDHA）、促凋亡（BAX、BAK）和抗增殖基因，以及細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶（ATR）。正如預(yù)期的那樣，這些選定基因的消除或沉默導(dǎo)致培養(yǎng)性能改善、凋亡抵抗增強(qiáng)和產(chǎn)品產(chǎn)量提高。參與染色質(zhì)重塑（例如HDACs）和糖基化（例如FUT8、SLC35C1）的基因也成為敲除研究的靶點(diǎn)，以更好地了解如何操縱細(xì)胞系以表達(dá)具有定制翻譯后修飾譜的重組蛋白。所有這些宿主細(xì)胞工程的成就都被視為成功故事，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致了CHO宿主衍生物的產(chǎn)生，這些衍生物在生長(zhǎng)、應(yīng)激抵抗和生產(chǎn)力方面超過(guò)了它們的親本細(xì)胞系。工程生產(chǎn)細(xì)胞系已被證明能夠?qū)崿F(xiàn)創(chuàng)紀(jì)錄的高3–7 g/L體積生產(chǎn)力。然而，監(jiān)測(cè)工業(yè)制造中生產(chǎn)效率的數(shù)據(jù)表明，在許多情況下，不可能從高滴度生產(chǎn)過(guò)程的生物反應(yīng)器中回收全部產(chǎn)品。由于這個(gè)下游處理瓶頸，產(chǎn)品似乎并未從非常高滴度中受益，進(jìn)一步提高滴度的努力可能帶來(lái)收益遞減。此外，在許多情況下，觀察到重組細(xì)胞系在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中活力和生產(chǎn)力下降，從而使工業(yè)界面臨進(jìn)一步挑戰(zhàn)。

4.工業(yè)細(xì)胞系開(kāi)發(fā)的新焦點(diǎn)領(lǐng)域

在2010年之前，許多生物制藥公司遵循開(kāi)發(fā)自己的生產(chǎn)細(xì)胞系的政策，但過(guò)去十年中這種方法發(fā)生了變化?，F(xiàn)在公司傾向于使用相同的宿主細(xì)胞系進(jìn)行生產(chǎn)和初期臨床試驗(yàn)，因?yàn)樗麄円庾R(shí)到這種策略簡(jiǎn)化了細(xì)胞系開(kāi)發(fā)周期，并優(yōu)化了通往臨床的道路。此外，它降低了產(chǎn)品可比性問(wèn)題的風(fēng)險(xiǎn)，并幫助制造商滿足產(chǎn)品質(zhì)量要求和一致性預(yù)期。這些變化的優(yōu)先事項(xiàng)促成了CHO表達(dá)平臺(tái)創(chuàng)新的新方向。工業(yè)細(xì)胞系開(kāi)發(fā)的焦點(diǎn)已轉(zhuǎn)向宿主細(xì)胞系穩(wěn)定性問(wèn)題，以確保穩(wěn)定的長(zhǎng)期生產(chǎn)，使用靶向整合技術(shù)進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，特別是對(duì)于復(fù)雜的工程重組治療劑，以及開(kāi)發(fā)選擇和篩選系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)更快、更有效的克隆選擇（圖1）。

圖1. 工業(yè)細(xì)胞系開(kāi)發(fā)中創(chuàng)新研究的當(dāng)前重點(diǎn)領(lǐng)域。

4.1.CHO細(xì)胞系不穩(wěn)定性

在制藥行業(yè)中使用的CHO細(xì)胞，以良好的適應(yīng)遺傳操作和改變培養(yǎng)條件的能力而著稱。這一特點(diǎn)源于這些細(xì)胞系本身具有可塑性的基因組，這使得它們適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。然而，不利的是，這種細(xì)胞可塑性使得CHO細(xì)胞更容易發(fā)生基因組重排（缺失、易位），并在生物生產(chǎn)過(guò)程中成為細(xì)胞系不穩(wěn)定的源頭。生產(chǎn)細(xì)胞面臨著高基因組和代謝需求，可能導(dǎo)致基因組和表觀遺傳變化，從而導(dǎo)致生產(chǎn)力和產(chǎn)品質(zhì)量下降。盡管如此，CHO細(xì)胞系提供的眾多優(yōu)勢(shì)使它們成為重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主，因此，科學(xué)和工業(yè)界在近期內(nèi)不太可能放棄這一表達(dá)系統(tǒng)。因此，最近已投入大量努力來(lái)理解CHO細(xì)胞系不穩(wěn)定的這一現(xiàn)象。研究重點(diǎn)是尋找解決方案，以克服制造過(guò)程中表型不穩(wěn)定的難題，確保長(zhǎng)期穩(wěn)定的生產(chǎn)、過(guò)程一致性，并確保產(chǎn)品質(zhì)量可接受。與所有其他快速生長(zhǎng)的永生化細(xì)胞一樣，CHO宿主細(xì)胞系在基因組上不穩(wěn)定且克隆內(nèi)異質(zhì)，這賦予了系統(tǒng)魯棒性和靈活性，但導(dǎo)致生產(chǎn)穩(wěn)定性問(wèn)題。為了更好地理解CHO細(xì)胞的異質(zhì)性，Borth及其團(tuán)隊(duì)在一系列實(shí)驗(yàn)中研究了在亞克隆和克隆選擇用于生產(chǎn)細(xì)胞系生成過(guò)程中，異質(zhì)性是如何傳遞的。他們發(fā)現(xiàn)，亞克隆本身并沒(méi)有導(dǎo)致亞克隆與原始細(xì)胞池相比（無(wú)論是宿主細(xì)胞系還是重組細(xì)胞系）遺傳和表型異質(zhì)性的減少。相反，選擇特定的細(xì)胞特性導(dǎo)致了核型同質(zhì)性和染色體穩(wěn)定性增加。Baik和Lee也研究了CHO細(xì)胞系不穩(wěn)定性、核型變異和生產(chǎn)不穩(wěn)定之間的聯(lián)系。他們提出了一個(gè)生產(chǎn)不穩(wěn)定的機(jī)制模型，其中隨機(jī)的染色體重排與生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和非生產(chǎn)或低生產(chǎn)克隆相關(guān)。同時(shí)，針對(duì)特定表型/基因型的MTX選擇降低了生長(zhǎng)速率，但提高了產(chǎn)品產(chǎn)量。在穩(wěn)定重組細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，一個(gè)重要的問(wèn)題是生成和識(shí)別高產(chǎn)克隆，這些克隆不會(huì)隨時(shí)間失去表達(dá)能力。（克隆性在治療蛋白生產(chǎn)中被認(rèn)為是關(guān)鍵的，因?yàn)榭寺∠当徽J(rèn)為能提供穩(wěn)定和一致的產(chǎn)品質(zhì)量特性。）然后需要在長(zhǎng)期培養(yǎng)中評(píng)估選定克隆的生產(chǎn)情況，這是一個(gè)勞動(dòng)密集型且耗時(shí)的過(guò)程。然而，目前在CHO細(xì)胞系上迅速積累的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為功能分析開(kāi)辟了道路，以識(shí)別高生產(chǎn)和克隆穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)因子和生物標(biāo)志物。按照這種方法，Ritter及其同事分析了低產(chǎn)和高產(chǎn)CHO克隆的基因表達(dá)譜，以尋找細(xì)胞工程的潛在目標(biāo)，使克隆選擇更快、更有效。他們發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)穩(wěn)定的高產(chǎn)克隆都標(biāo)記為染色體8的端粒區(qū)域缺失。建立的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果證實(shí)，與對(duì)照CHO-K1細(xì)胞相比，CHO-C8DEL細(xì)胞（染色體8的端粒區(qū)域缺失）表現(xiàn)出更高的體積生產(chǎn)率，并產(chǎn)生了更穩(wěn)定的生產(chǎn)克隆。進(jìn)一步地，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一系列敲除和敲低研究，并在選定的端粒區(qū)域內(nèi)確定了兩個(gè)特定目標(biāo)，F(xiàn)am60A和C12orf35，它們?cè)趧?chuàng)造CHO-C8DEL細(xì)胞觀察到的表型中起作用。據(jù)報(bào)道，這些基因的缺失或表達(dá)減少與更高的生產(chǎn)率和更快地從選擇中恢復(fù)相關(guān)。

4.2.靶向基因組操作技術(shù)

在重組細(xì)胞系生成中，最密集的研究方向集中在使用靶向基因組整合技術(shù)進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化。對(duì)于建立穩(wěn)定和克?。ㄍ矗┥a(chǎn)者細(xì)胞系，轉(zhuǎn)基因需要整合到宿主基因組中。傳統(tǒng)方法依賴于表達(dá)載體的隨機(jī)整合，隨后從具有異質(zhì)轉(zhuǎn)基因插入的重組細(xì)胞池中耗時(shí)篩選合適的細(xì)胞。這種方法有兩個(gè)主要缺點(diǎn)：整合效率低和整合位點(diǎn)的位置效應(yīng)。為克服這些問(wèn)題，人們做出了不同的嘗試。借助不同的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（Sleeping Beauty、Leap-in、PiggyBac、Tol2），成功提高了整合效率。據(jù)報(bào)道，使用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因整合僅在2-3周內(nèi)生成的重組CHO池能夠?qū)崿F(xiàn)異常高的產(chǎn)品滴度（>7 g/L），因此可用于快速生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)。借助轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的基因整合仍然是一個(gè)感興趣領(lǐng)域，并正在評(píng)估其在生物醫(yī)學(xué)研究不同領(lǐng)域的潛在用途。過(guò)去十年中，幾個(gè)研究小組也解決了由于隨機(jī)整合導(dǎo)致的“位置效應(yīng)”問(wèn)題。Neville等人綜述的普遍染色質(zhì)開(kāi)放元件（UCOEs）以及其他在高生產(chǎn)細(xì)胞基因組中識(shí)別的調(diào)控基序已被應(yīng)用于防止基因沉默并維持高水平表達(dá)。細(xì)菌人工染色體（BACs）也是一種流行且廣泛使用的方法，用于確保整合轉(zhuǎn)基因的位點(diǎn)獨(dú)立、穩(wěn)定和高水平表達(dá)（例如，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物反應(yīng)器中為選定抗體達(dá)到0.75 g/L，在搖瓶中達(dá)到1.12 g/L）。

靶向基因組操作技術(shù)使得重組蛋白編碼基因能夠敲入到定義良好且轉(zhuǎn)錄活躍的基因組位點(diǎn)中。與隨機(jī)整合相比，這是一種建立生產(chǎn)克隆的更快且更高效的方法。靶向細(xì)胞基因組修飾得益于目標(biāo)特異性基因編輯工具的出現(xiàn)，例如鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）-CRISPR相關(guān)蛋白9（Cas9）RNA引導(dǎo)的核酸酶。其中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其易用性（與ZFNs和TALENs相比）、高編輯效率和低成本而成為受歡迎的選擇?？删幊毯怂崦府a(chǎn)生雙鏈斷裂，這些斷裂在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過(guò)內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制解決。這些機(jī)制包括不同的途徑：i）非同源末端連接（NHEJ），ii）同源定向修復(fù)（HR）和iii）微同源介導(dǎo)的末端連接（MMEJ）。靶向基因組編輯工具的主要應(yīng)用涉及在細(xì)胞或生物體的基因組中敲除或敲入感興趣的基因。
近年來(lái)，人們投入了大量努力來(lái)識(shí)別宿主細(xì)胞基因組中的轉(zhuǎn)錄“熱點(diǎn)”。靶位點(diǎn)的選擇基于先前的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析或借助慢病毒篩選。不同研究小組最近使用的位點(diǎn)包括Fer1L4、Rosa26、Hprt、Hipp11、C12orf35和GS。如今，最先進(jìn)的技術(shù)是整合不僅單個(gè)轉(zhuǎn)基因，還有復(fù)雜的盒式結(jié)構(gòu)，稱為“著陸墊”，以生成主宿主細(xì)胞系。著陸墊包含選擇標(biāo)記和重組酶或整合酶的識(shí)別位點(diǎn)，允許精確插入任何種類(lèi)和任何數(shù)量的表達(dá)盒到已建立的位點(diǎn)。有許多系統(tǒng)已有效用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過(guò)位點(diǎn)特異性重組介導(dǎo)表達(dá)盒交換，例如Cre-loxP、Flp-FRT、BxB1重組酶、PhiC31整合酶（見(jiàn)表1）。

最近的一項(xiàng)研究報(bào)道了多著陸墊DNA整合平臺(tái)的開(kāi)發(fā)，該平臺(tái)在不同的基因組熱點(diǎn)插入了3-4個(gè)著陸墊，用于先進(jìn)的細(xì)胞工程。其他小組生成了替代版本，允許累積整合相同基因的多個(gè)拷貝或不同基因。然而，這種構(gòu)建可能會(huì)帶來(lái)重復(fù)介導(dǎo)的基因沉默問(wèn)題（也影響多順?lè)醋訕?gòu)建和彼此接近的基因），但有各種方法可用（例如使用表觀遺傳修飾元素，如絕緣子、UCOEs）來(lái)防止CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的沉默。上述討論的平臺(tái)已開(kāi)發(fā)用于促進(jìn)制藥行業(yè)中重組生產(chǎn)細(xì)胞系的生成。它們也是表達(dá)優(yōu)化新型復(fù)雜蛋白治療藥物的有價(jià)值且有前景的工具，并且可能應(yīng)用于合成生物學(xué)。

4.3.關(guān)于產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量的難以表達(dá)的重組蛋白治療藥物的表達(dá)優(yōu)化

目前，大量經(jīng)過(guò)工程改造的復(fù)雜重組蛋白正在填充工業(yè)生產(chǎn)管線。盡管使用了先進(jìn)的CHO細(xì)胞表達(dá)平臺(tái)，這些蛋白在許多情況下被證明是“難以表達(dá)”的（DTE）。制藥行業(yè)的一個(gè)主要?jiǎng)?chuàng)新研究領(lǐng)域集中在提高這些生物產(chǎn)品的可制造性。最近，不同研究小組進(jìn)行了多次嘗試，試圖理解生產(chǎn)瓶頸的原因，并尋求這些問(wèn)題的解決方案。

首先需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)優(yōu)化，這涉及表達(dá)構(gòu)建設(shè)計(jì)、基因組整合方法以及與整合位點(diǎn)的基因組環(huán)境的相互作用。即使在定義良好的整合位點(diǎn)，重組蛋白的轉(zhuǎn)錄水平也受到整合位點(diǎn)與表達(dá)盒組件之間相互作用的影響。對(duì)這一現(xiàn)象的研究對(duì)于可編程細(xì)胞工程至關(guān)重要，以便能夠預(yù)測(cè)多個(gè)組件如何貢獻(xiàn)于插入轉(zhuǎn)基因的最終凈表達(dá)。為解決這一問(wèn)題，Kildegaard及其同事開(kāi)發(fā)了一個(gè)分子工具箱，用于系統(tǒng)評(píng)估產(chǎn)品和位點(diǎn)特異性重組基因表達(dá)。

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，他們構(gòu)建了一系列具有針對(duì)著陸墊的靶向整合位點(diǎn)的CHO-S模型細(xì)胞系，其中重組基因在定義的50近端調(diào)控元件下。他們表明，不同的調(diào)控元件在定義的整合位點(diǎn)產(chǎn)生了強(qiáng)大的重組基因表達(dá)模式，具有廣泛的轉(zhuǎn)錄輸出。Cartwright及其同事報(bào)道了開(kāi)發(fā)高通量微型平臺(tái)用于多并行測(cè)試不同遺傳組件，并系統(tǒng)評(píng)估它們對(duì)DTE蛋白生產(chǎn)的影響。該小組旨在優(yōu)化細(xì)胞工程解決方案，用于模型DTE IgG的穩(wěn)定和瞬時(shí)生產(chǎn)。他們得出結(jié)論，最佳方法是產(chǎn)品和遺傳背景特異性的，并且穩(wěn)定和瞬時(shí)生產(chǎn)之間存在顯著差異。Tadauchi等人進(jìn)行了一項(xiàng)系統(tǒng)調(diào)查，旨在了解是什么使得抗體表達(dá)困難。他們構(gòu)建了具有定義基因組整合位點(diǎn)的著陸墊的模型細(xì)胞系，其中插入的轉(zhuǎn)基因在（Tet/Dox）誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。該系統(tǒng)使得能夠表征可能具有毒性或因任何原因難以表達(dá)的蛋白的表達(dá)。其他工作集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上，例如在miRNA介導(dǎo)（miR-557）的宿主細(xì)胞工程中，已被證明有助于增強(qiáng)DTE蛋白表達(dá)。

分泌缺陷是復(fù)雜治療藥物，特別是DTE單克隆抗體（如英夫利昔單抗）的另一個(gè)主要關(guān)注領(lǐng)域。針對(duì)這一問(wèn)題，不同研究團(tuán)隊(duì)采用了多種方法。在最近的研究中，Hussein等人描述了一種新的蛋白質(zhì)工程策略，以繞過(guò)分泌瓶頸，從而提高DTE蛋白的生產(chǎn)。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了逐步分析，以了解限制選定重組蛋白TIMP-3和TIMP-4生產(chǎn)的分子機(jī)制，并確定翻譯后處理阻滯是蛋白表達(dá)的限制步驟。為克服這一限制，他們構(gòu)建了一個(gè)融合蛋白，其中包含一個(gè)分泌生長(zhǎng)因子的短前序列，該序列具有蛋白酶furin的天然切割位點(diǎn)。同時(shí)，在同一實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)furin。這種策略已成功用于提高原本分泌不佳的TIMP家族兩個(gè)成員的蛋白生產(chǎn)。在該研究之后，應(yīng)用計(jì)算工具分析TIMP-3編碼核苷酸序列，以識(shí)別導(dǎo)致分泌不佳的序列特征。根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)用于DTE重組靶標(biāo)的蛋白質(zhì)嵌合體設(shè)計(jì)模型。Otte及其團(tuán)隊(duì)報(bào)告了建立一種基于自動(dòng)化共聚焦顯微鏡的方法，用于研究細(xì)胞內(nèi)DTE蛋白表達(dá)，以探索生產(chǎn)瓶頸的原因。在代表性研究中，Mathias等人追蹤了選定重組DTE蛋白在細(xì)胞合成過(guò)程中的處理，并調(diào)查了它們?cè)诜置谕緩较鄳?yīng)細(xì)胞器中的分布。他們發(fā)現(xiàn)，在選定抗體的情況下，錯(cuò)誤折疊是限制速率的步驟，也是阻礙分泌的原因，因?yàn)樗鼘?dǎo)致了分子的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解。

除了體積生產(chǎn)率外，產(chǎn)品質(zhì)量對(duì)于生物治療蛋白生產(chǎn)也至關(guān)重要，并且一直是工業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)努力的焦點(diǎn)。糖蛋白是生物治療藥物中增長(zhǎng)最快的類(lèi)別。正確的翻譯后修飾，特別是糖鏈結(jié)構(gòu)，對(duì)于這些生物制劑的效力以及藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性的控制至關(guān)重要。此外，不僅糖基化（唾液酸化、巖藻糖化）的性質(zhì)和數(shù)量重要，N-糖鏈的異質(zhì)性也可能是一個(gè)問(wèn)題。這種異質(zhì)性，由于N-糖鏈處理的變異性而產(chǎn)生，可能會(huì)損害糖治療藥物的活性和安全性。Yang及其同事描述了如何通過(guò)遺傳工程改造CHO細(xì)胞，以近乎均質(zhì)的形式生產(chǎn)糖蛋白。他們對(duì)CHO糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了敲除篩選，以識(shí)別控制N-連接糖基化關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵基因，并表明CHO細(xì)胞能夠耐受糖工程改造而不會(huì)發(fā)生補(bǔ)償性變化。根據(jù)他們的結(jié)果，他們提供了一種在模型細(xì)胞系中重建更均質(zhì)糖基化能力的策略。

4.4.高通量篩選和選擇系統(tǒng)的最新進(jìn)展

選擇系統(tǒng)在幾十年間已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，然而，不同選擇系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)仍然是一個(gè)爭(zhēng)論的話題，特別是在MTX選擇系統(tǒng)的情況下。幾項(xiàng)研究表明，由MTX選擇導(dǎo)致的基因擴(kuò)增是重組細(xì)胞系生產(chǎn)不穩(wěn)定性的一個(gè)主要原因。此外，多輪MTX選擇需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)生成細(xì)胞系。最近，Yeo等人也發(fā)表了一項(xiàng)大規(guī)模的比較研究，探討不同類(lèi)型的標(biāo)記基因如何影響不同CHO細(xì)胞系的生產(chǎn)穩(wěn)定性。他們的結(jié)果表明，需要針對(duì)不同類(lèi)型的CHO細(xì)胞優(yōu)化選擇標(biāo)記基因的表達(dá)，以提高對(duì)最佳生產(chǎn)者克隆的選擇嚴(yán)格性。

隨著市場(chǎng)對(duì)生物治療產(chǎn)品需求的增長(zhǎng)，時(shí)間和成本成為了制造過(guò)程中的重要因素。在過(guò)程設(shè)計(jì)和優(yōu)化中，更多地關(guān)注如何減少新生物產(chǎn)品重組細(xì)胞系生成所需的時(shí)間和成本。這推動(dòng)了高通量克隆篩選和表征的新方法和技術(shù)的發(fā)展。許多改進(jìn)工作集中在單克隆上，因?yàn)檫@是生產(chǎn)者細(xì)胞系建立過(guò)程中最耗時(shí)的環(huán)節(jié)。現(xiàn)在已有幾種新技術(shù)可用于更有效地分離單細(xì)胞，取代傳統(tǒng)的“限制稀釋”方法。現(xiàn)代克隆方法使用專門(mén)的儀器來(lái)確保單個(gè)細(xì)胞被播種到微量滴定板孔中。熒光激活細(xì)胞分選（FACS）已成功用于根據(jù)特定細(xì)胞屬性（表明高生產(chǎn)性）對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分選。Solentim開(kāi)發(fā)的VIPS（原位驗(yàn)證板播種）以及Cytena單細(xì)胞打印機(jī)儀器結(jié)合了細(xì)胞播種與顯微鏡成像，以確保單細(xì)胞沉積，從而保證衍生克隆的單細(xì)胞起源。Berkeley Lights的Beacon平臺(tái)利用微流體和光電子定位技術(shù)，通過(guò)軟件控制操作，在單芯片上并行培養(yǎng)、操縱和表征數(shù)千個(gè)細(xì)胞。ClonePX FL提供了一種基于表達(dá)的方法，在半固體培養(yǎng)基上，用于高效高生產(chǎn)者克隆/菌落的選擇和分離。

許多這些技術(shù)發(fā)展和現(xiàn)代儀器為高通量自動(dòng)化過(guò)程提供了可能，已經(jīng)在制藥行業(yè)成功引入，并現(xiàn)在應(yīng)用于工業(yè)重組蛋白生產(chǎn)。

4.5.“組學(xué)”技術(shù)——系統(tǒng)生物學(xué)方法

自2010年代以來(lái)，“組學(xué)”方法和“組學(xué)”技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了對(duì)細(xì)胞特征和身份特征的深入理解，這些特征表明了最佳生產(chǎn)狀態(tài)。在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)領(lǐng)域，現(xiàn)在有大量的數(shù)據(jù)（并且每天都在增加），這些數(shù)據(jù)提供了對(duì)特定時(shí)刻細(xì)胞狀態(tài)和特征的系統(tǒng)級(jí)洞察。Stolfa等人發(fā)表了關(guān)于CHO的可用資源和數(shù)據(jù)庫(kù)的全面總結(jié)。與此同時(shí)，生物信息學(xué)中計(jì)算方法和算法的不斷發(fā)展使得這些“組學(xué)”數(shù)據(jù)能夠被轉(zhuǎn)化為與細(xì)胞機(jī)制和功能相關(guān)的生物學(xué)信息。這些信息與計(jì)算建模一起被用于CHO研究的所有領(lǐng)域：用于預(yù)測(cè)細(xì)胞行為，探索重組細(xì)胞系中不同生產(chǎn)效率背后的轉(zhuǎn)錄組水平克隆變異，或識(shí)別操縱生產(chǎn)者細(xì)胞系應(yīng)激反應(yīng)和敏感性的新靶點(diǎn)。在最近的一項(xiàng)研究中，Kol等人進(jìn)行了多重分泌組分析，以研究宿主細(xì)胞蛋白對(duì)重組蛋白生產(chǎn)的影響。通過(guò)系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)（計(jì)算篩選）和體外分析，Nguyen等人從CHO細(xì)胞中識(shí)別出內(nèi)源性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元素，這些元素可用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)優(yōu)化的潛在用途。Brown及其同事進(jìn)行了基于轉(zhuǎn)錄組的分析，以識(shí)別用于qPCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的最佳參考CHO基因。該研究結(jié)果已適應(yīng)于制藥行業(yè)常規(guī)用于生產(chǎn)者細(xì)胞系穩(wěn)定性表征。隨著“組學(xué)”技術(shù)的進(jìn)步，糖基化譜的系統(tǒng)分析為CHO細(xì)胞的糖基化網(wǎng)絡(luò)提供了新的見(jiàn)解，并有助于開(kāi)發(fā)新的糖工程策略，旨在產(chǎn)生更有效的療法，減少副作用——正如Tejwani等人在一篇全面的綜述中總結(jié)的那樣。Stach等人描述了一種將系統(tǒng)級(jí)動(dòng)力學(xué)模型與合成生物學(xué)相結(jié)合的方法，以研究N-糖基化的本質(zhì)，并測(cè)試遺傳擾動(dòng)對(duì)產(chǎn)生IgG的半乳糖化行為的協(xié)同作用。

5.未來(lái)展望

系統(tǒng)生物學(xué)方法為增強(qiáng)基于CHO的生物生產(chǎn)開(kāi)辟了新的維度。“組學(xué)”技術(shù)提供了更好地表征和理解復(fù)雜細(xì)胞功能的新機(jī)會(huì)，從而為機(jī)制驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞系優(yōu)化創(chuàng)造了基礎(chǔ)，而不是操縱幾個(gè)關(guān)鍵基因。然而，一個(gè)主要問(wèn)題是這些現(xiàn)代技術(shù)需要特殊的儀器、材料和先進(jìn)的信息技術(shù)設(shè)施，因此它們?nèi)匀贿^(guò)于復(fù)雜和昂貴，無(wú)法在工業(yè)制造中常規(guī)使用。另一方面，迄今為止不同“組學(xué)”技術(shù)提供的數(shù)據(jù)還無(wú)法整合到一個(gè)通用的數(shù)學(xué)模型中，這將有助于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)計(jì)中轉(zhuǎn)移和應(yīng)用這些信息。如何將這些知識(shí)適應(yīng)并整合到關(guān)于重組蛋白生產(chǎn)的工業(yè)生物過(guò)程優(yōu)化和開(kāi)發(fā)中仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，需要在未來(lái)解決。