Protein A 親和層析是一種高效且特異性強(qiáng)的純化技術(shù)，廣泛應(yīng)用于單克隆抗體(mAb)及具有Fc結(jié)構(gòu)域的分子如融合蛋白和雙特異性抗體的捕獲。然而，傳統(tǒng)的Protein A 親和層析在洗脫過(guò)程中需要使用低pH(3.0-4.0)，這不僅可能導(dǎo)致對(duì)低pH敏感的分子產(chǎn)物降解，例如碎片化、聚集等，而且對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。

為了解決這一問(wèn)題，研究人員開發(fā)了新型的Protein A 填料，其配基設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，能夠在較溫和的pH條件下實(shí)現(xiàn)洗脫。例如，Purolite公司推出的Praesto Jetted A50 HipH填料，通過(guò)對(duì)其Fc和VH3結(jié)合區(qū)的序列進(jìn)行修改，使其能夠在pH 4.6或更高的條件下洗脫Fc融合蛋白和大多數(shù)mAb。優(yōu)化后的洗脫和洗滌條件不僅實(shí)現(xiàn)了高回收率(>90%單體收率)，還顯著減少了高分子量(HMW)物質(zhì)(>50%)，并在盡可能溫和的洗脫pH下有效清除了宿主細(xì)胞蛋白(HCP)。

對(duì)于pH穩(wěn)定的mAb和pH敏感的融合蛋白，在優(yōu)化條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物料的純化，結(jié)果表明，溫和洗脫pH填料能夠以可接受的收率純化產(chǎn)物，雜質(zhì)清除率相當(dāng)或更好，且與傳統(tǒng)填料相比，天然洗脫液pH明顯更溫和。特別是在pH敏感蛋白的純化中，優(yōu)勢(shì)更加明顯，使用溫和洗脫緩沖液和天然洗脫pH，洗脫液中HMW含量在48小時(shí)內(nèi)僅有2%保持穩(wěn)定。而傳統(tǒng)需要低pH洗脫的Protein A填料，洗脫液HMW水平則為8%，在相同保持時(shí)間內(nèi)增加到16%。

此外，這些新型填料還具有高動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，并允許使用傳統(tǒng)的HCP洗滌方法。因此，Praesto Jetted A50 HipH填料成為平臺(tái)Protein A填料的理想候選者，為pH敏感蛋白和穩(wěn)定的mAb提供了更大的靈活性，同時(shí)確保了產(chǎn)物質(zhì)量、收率以及與下游工藝的無(wú)縫集成。

亮點(diǎn)

?ProA 配基的 Fc 和VH3 結(jié)合區(qū)的修改可以允許溫和的洗脫 pH。

?Jetted A50 HipH 可以在 pH 4.6 或以上時(shí)洗脫含 Fc 的蛋白質(zhì)。

?可以實(shí)現(xiàn)溫和的洗脫 pH 值并實(shí)現(xiàn)高收率以及 >50% 的 HMW 減少率。

?pH敏感蛋白質(zhì)可以在穩(wěn)定的pH區(qū)域內(nèi)洗脫，并且隨時(shí)間保持穩(wěn)定。

? Jetted A50 HipH 是一種適用于穩(wěn)定和不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的靈活平臺(tái) ProA 填料。

簡(jiǎn)介

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，抗體及其相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)經(jīng)歷了顯著的增長(zhǎng)，逐漸成為生物制藥領(lǐng)域中的主導(dǎo)產(chǎn)品類別。這一增長(zhǎng)趨勢(shì)不僅推動(dòng)了對(duì)這些產(chǎn)品需求的不斷攀升，也促使上游和下游工藝技術(shù)迅速發(fā)展，以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。

在單克隆抗體(mAb)或Fc融合蛋白的純化過(guò)程中，Protein A親和層析作為一種關(guān)鍵的初步捕獲步驟，被廣泛應(yīng)用于從細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中分離目標(biāo)產(chǎn)物。該技術(shù)利用來(lái)自金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的天然或重組Protein A配基，將其與基質(zhì)偶聯(lián)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的特異性結(jié)合。

天然Protein A由五個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(E、D、A、B和C)組成，這些結(jié)構(gòu)域均能與免疫球蛋白G(IgG)的Fc區(qū)發(fā)生相互作用，尤其對(duì)IgG1、IgG2和IgG4亞型表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力。由于Protein A填料具有高選擇性和結(jié)合親和力，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)純化過(guò)程中被廣泛應(yīng)用于含F(xiàn)c分子的平臺(tái)方法中，成為不可或缺的一部分。

為了進(jìn)一步提升Protein A填料的性能，多年來(lái)研究人員通過(guò)工程改造Protein A配基或填料基質(zhì)，做出了諸多努力和改進(jìn)。這些改造主要集中在提高填料的結(jié)合載量和堿穩(wěn)定性方面，以滿足工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)高效率和高純度蛋白質(zhì)純化的需求。通過(guò)這些不斷的技術(shù)創(chuàng)新和優(yōu)化，Protein A親和層析技術(shù)得以在生物制藥領(lǐng)域持續(xù)發(fā)揮其重要作用，為抗體和抗體相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了有力支持。

在生物制藥領(lǐng)域，Protein A填料是單克隆抗體(mAb)純化過(guò)程中不可或缺的工具，其通過(guò)與抗體的Fc區(qū)域特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高效的捕獲和純化。然而，對(duì)于Fc融合蛋白等對(duì)低pH敏感的蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)的Protein A填料在低pH洗脫條件下可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，影響藥物的安全性和有效性。因此，開發(fā)新型的Protein A填料或優(yōu)化純化工藝，以降低低pH敏感蛋白質(zhì)的聚集風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于提高Fc融合蛋白等藥物的生產(chǎn)質(zhì)量和效率具有重要意義。

研究表明，在洗脫緩沖液中添加穩(wěn)定劑或采用提高洗脫pH值的策略，例如使用高濃度的氯化鈉、氯化鎂或精氨酸溶液，可有效抑制聚體的形成。然而，為了與后續(xù)的精純步驟更好地銜接，通常需要額外的步驟來(lái)去除這些添加物，以達(dá)到預(yù)期的效果。

針對(duì)對(duì)低pH敏感的分子，一種Protein A層析的策略是直接中和洗脫液，以減少其在低pH條件下的暴露時(shí)間，從而大程度地降低聚體的形成。這需要在收集容器中預(yù)先準(zhǔn)備好適量的中和緩沖液，以便洗脫液一加入即被中和。中和緩沖液與洗脫液的準(zhǔn)確體積和比例至關(guān)重要，以確保洗脫液的pH值迅速進(jìn)入分子穩(wěn)定的范圍。這種策略可以有效減少蛋白質(zhì)聚集，使得傳統(tǒng)的Protein A層析可用于純化低pH敏感分子。然而，該方法需要精確控制，以確保在大規(guī)模生產(chǎn)中能夠快速且充分地混合，這增加了工藝的復(fù)雜度。此外，該工藝的穩(wěn)定性和靈活性較差，因?yàn)楸仨毟鶕?jù)預(yù)定的洗脫體積提前制備中和緩沖液體積。對(duì)于那些在低pH洗脫過(guò)程中容易在柱上快速聚集的分子，該策略的應(yīng)用也受到限制。

為了應(yīng)對(duì)純化pH敏感抗體和Fc融合蛋白所面臨的挑戰(zhàn)，Repligen與Navigo Proteins合作，開發(fā)出了一種新型的Protein A原型填料，該填料具備在較溫和的pH條件下進(jìn)行洗脫的能力。具體來(lái)說(shuō)，研究人員通過(guò)對(duì)五個(gè)Protein A野生型結(jié)構(gòu)域的序列片段進(jìn)行重組，創(chuàng)造出全新的Protein A樣序列，從而制備出一種“人造”的馬賽克式Protein A等價(jià)物。此外，通過(guò)在不同位置引入定點(diǎn)突變，構(gòu)建了一個(gè)小型的突變庫(kù)，并從中篩選出具有更優(yōu)洗脫pH特性的配基。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將野生型氨基酸替換為組氨酸可以最有效地提高洗脫pH。由于這些序列修改發(fā)生在Protein A分子的Fc和VH3結(jié)合區(qū)內(nèi)，因此與野生型序列相比，在較溫和的酸性pH下，其結(jié)合親和力有所降低，但保留了在中性pH下的Fc結(jié)合親和力，以促進(jìn)產(chǎn)物的結(jié)合。通過(guò)篩選過(guò)程，研究人員確定了數(shù)種能夠在較溫和pH下洗脫的Protein A配基候選物。最終，選擇了兩種配基作為主要候選配基，它們均能在較溫和的pH下實(shí)現(xiàn)洗脫，同時(shí)保持較高的結(jié)合載量。盡管Protein A的主要結(jié)合活性是通過(guò)抗體的Fc部分實(shí)現(xiàn)的，但它也能以不同的模式與VH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這兩種候選配基在與抗體VH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力上存在差異：其中一種候選配基僅對(duì)非VH3抗體表現(xiàn)出溫和的洗脫能力，而另一種候選配基則在VH3結(jié)合區(qū)含有額外的氨基酸突變，使其對(duì)VH3和非VH3抗體均具有溫和的洗脫能力。利用這兩種主要候選配基，研究人員制備了兩種原型填料，并對(duì)其性能進(jìn)行了評(píng)估，相關(guān)結(jié)果詳見本文。

隨后，Repligen和Navigo Proteins與Purolite合作，致力于將該原型填料進(jìn)行放大和商業(yè)化。該原型填料能夠?qū)H3和非VH3抗體均實(shí)現(xiàn)溫和的洗脫，并最終被商業(yè)化為Praesto® Jetted A50 HipH填料。Praesto® Jetted A50 HipH填料結(jié)合了Repligen的NGL-Impact A HipH配基，并采用了Purolite的噴射技術(shù)制造的Jetted A50基礎(chǔ)基質(zhì)。

隨著抗體相關(guān)候選藥物組合的日益多樣化，對(duì)Protein A層析過(guò)程中更靈活的洗脫條件的需求也在不斷增長(zhǎng)。在本研究中，我們對(duì)兩種專為較溫和pH洗脫設(shè)計(jì)的Protein A填料（Jetted A50 HipH和原型HipH-002）進(jìn)行了評(píng)估，并將其與兩種廣泛使用的商用Protein A填料（Jetted A50和MabSelect SuRe）進(jìn)行了比較，主要考察了它們的洗脫pH、動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（DBC）以及雜質(zhì)去除能力。此外，我們還通過(guò)穩(wěn)定性研究，檢驗(yàn)了洗脫pH對(duì)pH敏感分子的影響。

詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果，請(qǐng)參考原文。

實(shí)驗(yàn)中使用的填料的性質(zhì)

結(jié)果

脈沖注射實(shí)驗(yàn)

對(duì)表中列出的四種 Protein A 填料進(jìn)行脈沖進(jìn)樣，然后以 pH 7.0 至 3.0 的線性 pH梯度進(jìn)行洗脫。如圖 1、圖 2所示，對(duì)于所有測(cè)試的分子，Jetted A50 HipH 和 HipH-002 填料的洗脫 pH 明顯高于現(xiàn)有的 Protein A 填料（Jetted A50 和 MabSelect SuRe）。

圖 1.Protein A 填料上 Fc1 的洗脫 pH 值，定義為 UV 峰最大值的pH 值，通過(guò) pH 7.0 至 3.0 的線性 pH 梯度脈沖注射確定。

圖 2. 5種mAb 在Protein A 填料上的洗脫 pH 值比較（定義為 UV 峰最大值的 pH 值），通過(guò)pH 7.0 至 3.0 的線性 pH 梯度脈沖注射確定。

圖 1顯示了線性 pH 梯度上 Fc1 洗脫曲線的 UV 軌跡。對(duì)于Fc1，在填料 Jetted A50 HipH 和HipH-002 上，洗脫峰最大值時(shí)的 pH 分別為 4.8 和 5.2。傳統(tǒng)Protein A 填料Jetted A50 和 MabSelect SuRe 的峰最大值分別為 pH 3.5 和 3.4。Fc1 是一種 Fc 融合蛋白，據(jù)觀察，在 pH 4.5 以下時(shí)聚體形成增加。使用傳統(tǒng)Protein A 填料時(shí)，需要低 pH 緩沖液來(lái)洗脫 Fc1，并且需要直接中和策略來(lái)最大限度地減少分子在低 pH 條件下的暴露時(shí)間。相比之下，本研究中評(píng)估的 HipH 填料提供了明顯更高的洗脫 pH，這使得可以直接回收穩(wěn)定 pH 區(qū)域（> pH 4.5）內(nèi)的 Fc1。

圖 2總結(jié)了所評(píng)估的5種 mAb 的洗脫 pH。對(duì)于所有分子，傳統(tǒng)Protein A 填料始終在 pH 3.4–3.7 下洗脫，表明需要低 pH 值才能打破 mAb 與傳統(tǒng)Protein A 配基之間的相互作用。Jetted A50 HipH 對(duì)mAb 2–5 顯示出非常一致的溫和洗脫 pH，洗脫峰最大值在pH 4.6 和 4.7 之間。研究中的一個(gè)例外是 mAb1，其洗脫峰最大值發(fā)生在 pH 4.2。這種差異可能歸因于 mAb1 的序列或結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致 mAb 與 Jetted A50 HipH 配基之間產(chǎn)生更強(qiáng)的結(jié)合相互作用。HippH-002 對(duì)測(cè)試的 mAb 具有更多可變的洗脫 pH，洗脫峰最大值范圍為 pH 3.7 至 4.7。與 Jetted A50 HipH 填料相比，mAb 2、3 和 4 在 HipH-002 填料上的洗脫 pH 值較低，表明與 HipH-002 配基的結(jié)合親和力更強(qiáng)。這歸因于 HipH-002 配基的 VH3 結(jié)合親和力，因?yàn)檫@三種 mAb 均源自人 VH3 家族。此外，不同的 VH3 序列可能導(dǎo)致對(duì)相同配基的不同親和力，這可以解釋 mAb 2、3 和 4 在 HipH-002 上的洗脫pH 值差異。源自人 VH1 家族的 mAb 1 和 mAb 5 在 Jetted A50 HipH和 HipH-002 上具有相似的洗脫 pH 值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于對(duì)Jetted A50 HipH和HipH-002配基進(jìn)行了序列上的改良，這兩種填料均能在比傳統(tǒng)填料更溫和的pH條件下實(shí)現(xiàn)洗脫。原型HipH-002配基僅對(duì)非VH3抗體表現(xiàn)出穩(wěn)定的洗脫性能，這是因?yàn)槠鋵?duì)VH3區(qū)域的結(jié)合親和力可能因特定VH3序列的不同而存在更寬的洗脫pH范圍。相比之下，Jetted A50 HipH是一種更為通用的溫和洗脫pH填料，適用于所有含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)，不受IgG類型或VH家族的限制。由于Jetted A50 HipH配基在VH3結(jié)合區(qū)引入了額外的突變，使其能夠溫和地洗脫VH3和非VH3抗體，因此與傳統(tǒng)Protein A填料相比，預(yù)計(jì)所有含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)都可以在更溫和的洗脫pH下實(shí)現(xiàn)洗脫。然而，對(duì)于每種目標(biāo)蛋白質(zhì)，仍需進(jìn)行實(shí)際實(shí)驗(yàn)以了解其具體的洗脫行為。在本研究中評(píng)估的6種蛋白質(zhì)中，有5種在pH 4.6以上從Jetted A50 HipH中洗脫，而所有蛋白質(zhì)均在pH 4.2以上洗脫。相比之下，Pabst等人評(píng)估了9種分子在12種市售傳統(tǒng)Protein A填料上的洗脫pH行為，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白質(zhì)-填料組合的洗脫pH范圍為3.5-3.8。對(duì)于傳統(tǒng)Protein A填料而言，F(xiàn)c結(jié)合親和力僅在低pH條件下（如<pH 4.0）降低，蛋白質(zhì)也只能在此pH以下洗脫。而HipH配基的修飾序列則在較溫和的酸性pH下降低了Fc結(jié)合親和力，從而允許在更溫和的pH條件下實(shí)現(xiàn)洗脫。

動(dòng)態(tài)結(jié)合載量

在6分鐘的保留時(shí)間內(nèi)，使用四種Protein A填料測(cè)定了mAb1、mAb2和Fc1在10%穿透時(shí)的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（DBC）。表3總結(jié)了這三種分子在四種填料上獲得的DBC值。由于Fc1的分子量大約是典型單克隆抗體的一半，因此其每單位體積填料的蛋白質(zhì)質(zhì)量動(dòng)態(tài)結(jié)合載量預(yù)期較低。對(duì)于Fc1，Jetted A50 HipH和HipH-002的結(jié)合載量介于MabSelect SuRe和Jetted A50之間。需要注意的是，由于每種融合分子的設(shè)計(jì)都是獨(dú)特的，因此這些數(shù)據(jù)可能無(wú)法預(yù)測(cè)其他Fc融合蛋白的性能。對(duì)于mAb1和mAb2，Jetted A50 HipH和HipH-002展現(xiàn)出與Jetted A50相當(dāng)?shù)母邉?dòng)態(tài)結(jié)合載量，且比MabSelect SuRe的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量高出40-70%。這一結(jié)果在意料之中，因?yàn)镠ipH填料與Jetted A50共享相同的基礎(chǔ)填料基球。

表3.4種 Protein A 填料上 mAb 和Fc 融合蛋白的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量。

高分子量（HMW）餾分的梯度洗脫實(shí)驗(yàn)

盡管Protein A層析通常不降低高分子量（HMW）雜質(zhì)的水平，但先前的研究指出，通過(guò)線性pH梯度洗脫可以實(shí)現(xiàn)聚體和單體的分離，因?yàn)榫垠w對(duì)配基的親和力更強(qiáng)。然而，在傳統(tǒng)Protein A填料上，找到一個(gè)穩(wěn)定的操作空間以選擇性地洗脫單體是非常具有挑戰(zhàn)性的。

圖3展示了四種Protein A填料在20個(gè)柱體積（CV）洗脫梯度過(guò)程中，F(xiàn)c1的紫外（UV）吸收軌跡，其中pH值逐漸降低。色譜圖上疊加的圖表顯示了各餾分中收集的累積高分子量（HMW）雜質(zhì)回收率。對(duì)于所有四種Protein A填料，UV軌跡上均出現(xiàn)了一個(gè)后肩，表明后續(xù)餾分中含有較高比例的HMW雜質(zhì)，這說(shuō)明HMW雜質(zhì)與填料的結(jié)合更為牢固，需要更低的pH值才能實(shí)現(xiàn)洗脫。由于HipH填料能夠在較溫和的pH條件下實(shí)現(xiàn)洗脫，因此與現(xiàn)有的Protein A填料相比，其在單體和聚體的分離度上表現(xiàn)得更為出色。表4比較了UV峰最大值出現(xiàn)時(shí)的pH值（代表大多數(shù)蛋白質(zhì)洗脫的位置）以及實(shí)現(xiàn)50% HMW雜質(zhì)去除的pH值，后者相當(dāng)于累積HMW雜質(zhì)回收率達(dá)到50%。在這兩個(gè)pH值之間進(jìn)行洗脫，可以在獲得高蛋白質(zhì)回收率的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)超過(guò)50%的HMW雜質(zhì)去除率。對(duì)于HipH填料，UV峰最大值和50% HMW雜質(zhì)去除率之間的pH差異為0.6個(gè)pH單位，而傳統(tǒng)填料的pH差異僅為0.3個(gè)pH單位。HipH填料的pH差異較大，表明單體與聚體之間的結(jié)合親和力差異更為顯著，從而為提高該純化步驟的純度提供了更大的操作空間。

圖 3. Protein A 填料上 Fc1 的紫外吸光度和累積 HMW 回收率。所有運(yùn)行均采用 20 CV 下降線性梯度，Jetted A50 HipH 和 HipH-002 從 pH 7.0 下降至 3.0，Jetted A50 和MabSelect SuRe 從 pH 4.5 下降至 3.0。收集餾分以測(cè)量每個(gè)餾分中的 HMW 水平，并計(jì)算與上樣中的 HMW 相比的累積洗脫 HMW。

表4. 在4種Protein A 填料上使用線性梯度分離 HMW。

較溫和的洗脫pH填料為洗脫條件提供了更寬的操作范圍，從而使得在Protein A層析過(guò)程中能更有效地去除高分子量（HMW）雜質(zhì)。洗脫pH可根據(jù)分子特性進(jìn)一步優(yōu)化，以在收率和HMW雜質(zhì)去除之間達(dá)到最佳平衡。在Protein A捕獲步驟中顯著降低HMW雜質(zhì)含量，可減輕后續(xù)精純步驟的雜質(zhì)去除壓力，進(jìn)而提升整個(gè)下游工藝的效率。

等度洗脫評(píng)價(jià)

根據(jù)線性梯度上 mAb1 和 Fc1 的洗脫峰最大 pH 值，對(duì)它們進(jìn)行了等度洗脫運(yùn)行，評(píng)估了幾種不同的洗脫 pH 值。每次運(yùn)行的載量為 DBC 載量的 85%，穿透率為 10%。

圖 4總結(jié)了等度洗脫實(shí)驗(yàn)中的單體收率和洗脫液 HMW 結(jié)果。圖中顯示的是單體收率，而不是總收率，以考慮被去除的聚體量。

圖 4. 使用Fc1 和 mAb1 在Protein A 填料上進(jìn)行等度洗脫實(shí)驗(yàn)時(shí)單體收率和洗脫液 HMW 水平。Fc1 測(cè)試了 5 個(gè)洗脫 pH，最高 pH 為 5.5；mAb1 測(cè)試了 4 個(gè)洗脫 pH，最高 pH 為 4.4。上樣中的起始 HMW水平為 Fc1 的 7.1% 和 mAb1 的 8.7%。由于產(chǎn)物回收率低，沒(méi)有對(duì)所有 Jetted A50 和 MabSelect SuRe 洗脫液進(jìn)行 HMW 測(cè)量。

圖4左側(cè)的圖表匯總了Fc1的等度洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，洗脫緩沖液的pH值分別為5.5、5.2、4.9、4.6和3.5。對(duì)于HipH-002填料，在洗脫pH值為5.2或更低時(shí)，單體收率超過(guò)88%。在pH值5.5和5.2時(shí)，HipH-002的收率高于Jetted A50 HipH。這一觀察結(jié)果與脈沖注射和梯度洗脫數(shù)據(jù)相一致，其中HipH-002的洗脫峰最大pH值高于Jetted A50 HipH。正如預(yù)期，Jetted A50和MabSelect SuRe僅在洗脫pH值為3.5時(shí)才能實(shí)現(xiàn)高收率。需要低pH值才能將分子從傳統(tǒng)的Protein A填料上洗脫，但這也會(huì)導(dǎo)致結(jié)合在柱上的HMW雜質(zhì)一同洗脫，使得HMW雜質(zhì)的去除率極低。相比之下，在Jetted A50 HipH和HipH-002上使用pH 5.2進(jìn)行洗脫，可獲得高Fc1收率，且洗脫液中的HMW雜質(zhì)水平分別從上樣中的7.1%降低至2.0%和2.9%。這表明HipH填料具有額外的優(yōu)勢(shì)，即通過(guò)擴(kuò)大洗脫pH范圍來(lái)改善聚體的去除。

圖4右側(cè)的圖表匯總了使用pH值為4.4、4.2、4.0和3.5的洗脫緩沖液對(duì)mAb1進(jìn)行等度洗脫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。當(dāng)洗脫pH值為4.4或更低時(shí)，HipH填料的單體收率超過(guò)90%。在pH 4.4時(shí)，Jetted A50 HipH的收率略高于HipH-002，這與脈沖注射數(shù)據(jù)一致，其中Jetted A50 HipH的洗脫峰最大pH略高于HipH-002。與Fc1類似，使用Jetted A50和MabSelect SuRe純化mAb1時(shí)，僅在采用pH為3.5的洗脫緩沖液時(shí)才能獲得高收率，但此時(shí)HMW雜質(zhì)的去除率極低。相比之下，當(dāng)在Jetted A50 HipH和HipH-002上以pH 4.4進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫液中的HMW雜質(zhì)水平分別從上樣中的8.7%降低至4.7%和4.2%。

在后續(xù)討論的實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)每種分子選擇具有最溫和洗脫pH值的HipH填料，用于洗滌緩沖液的篩選，并利用澄清的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物來(lái)評(píng)估工藝性能和產(chǎn)物質(zhì)量。具體而言，對(duì)于Fc1的純化，進(jìn)一步在HipH-002上進(jìn)行評(píng)估；而對(duì)于mAb1的純化，則進(jìn)一步在Jetted A50 HipH上進(jìn)行評(píng)估。

洗滌條件評(píng)估

Protein A層析對(duì)含F(xiàn)c蛋白具有高選擇性和親和力，有望高效清除工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞蛋白（HCP）?？梢酝ㄟ^(guò)使用不同的添加物或調(diào)節(jié)pH值的中間洗滌步驟來(lái)增強(qiáng)對(duì)松散結(jié)合的HCP甚至難以去除的HCP的清除效果。這被證明是減輕后續(xù)精純步驟負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵有效方法。因此，本文評(píng)估了表5和表6中列出的Protein A層析常用洗滌緩沖液在HipH填料上清除HCP的效果及其對(duì)產(chǎn)量的影響。此次評(píng)估的目的是確定，在HipH填料的結(jié)合親和力發(fā)生變化的情況下，使用傳統(tǒng)洗滌緩沖液是否仍能有效清除HCP并實(shí)現(xiàn)高回收率。

表5.不同洗滌緩沖液對(duì)Fc1的收率和宿主細(xì)胞蛋白清除率的影響。

表6.不同洗滌緩沖液對(duì)mAb1收率和宿主細(xì)胞蛋白清除率的影響

在HipH-002上對(duì)Fc1進(jìn)行洗滌評(píng)估實(shí)驗(yàn)，使用表5所示的8種不同洗滌劑各三個(gè)柱體積，并采用pH為5.2的洗脫緩沖液。每次運(yùn)行的收率均標(biāo)準(zhǔn)化為無(wú)洗滌對(duì)照運(yùn)行的收率，以確定洗滌步驟導(dǎo)致的具體收率損失。50 mM辛酸鈉與1 M精氨酸（pH 7.0）的組合以及1 M精氨酸（pH 6.5）的組合可實(shí)現(xiàn)最高的HCP清除率。這一結(jié)果與之前在傳統(tǒng)Protein A填料上清除Fc1的HCP的經(jīng)驗(yàn)相符。為了在收率和HCP清除率之間取得平衡，50 mM辛酸鈉和1 M精氨酸（pH 7.0）被確定為Fc1 HCP清除的最佳洗滌劑組合。同樣，在Jetted A50 HipH上對(duì)Fc1進(jìn)行了洗滌緩沖液篩選，使用相同的洗脫緩沖液pH 5.2和表5所示的洗滌緩沖液，顯示出與HipH-002相似的收率和HCP去除趨勢(shì)。然而，與HipH-002上的運(yùn)行相比，Jetted A50 HipH上所有運(yùn)行的收率略低（數(shù)據(jù)未展示），這與等度洗脫評(píng)估的預(yù)期一致。

此外，當(dāng)采用1 M pH 6.0的精氨酸作為洗滌緩沖液時(shí)，洗滌過(guò)程中的收率損失達(dá)到65%。這一結(jié)果表明，高濃度的精氨酸和較低的pH值在削弱蛋白質(zhì)與配基之間的相互作用方面發(fā)揮了重要作用。這也意味著，若需采用更溫和的pH值，可在溫和洗脫pH填料上添加精氨酸等改性劑，以進(jìn)一步提升洗脫pH值。

對(duì)于mAb1，在Jetted A50 HipH上使用表6中所示的6種洗滌緩沖液各三倍柱體積，并采用pH為4.4的洗脫緩沖液進(jìn)行洗滌評(píng)估實(shí)驗(yàn)。初步研究表明，使用pH為6.5的洗滌緩沖液會(huì)導(dǎo)致顯著的收率損失，因此這些緩沖液未被包含在mAb1的洗滌評(píng)估中。含有1 M精氨酸和50 mM辛酸鈉的洗滌條件與無(wú)洗滌運(yùn)行相比導(dǎo)致收率損失，并展示了HCP去除與回收率之間的權(quán)衡。為了在收率和HCP清除率之間取得平衡，確定pH為7.0的0.5 M精氨酸是mAb1 HCP清除的最佳洗滌劑。同樣，在HipH-002上對(duì)mAb1進(jìn)行了洗滌緩沖液篩選，使用相同的pH為4.4的洗脫緩沖液和表6中所示的洗滌緩沖液，顯示出與Jetted A50 HipH相似的收率和HCP去除趨勢(shì)。然而，與Jetted A50 HipH上的運(yùn)行相比，HipH-002上所有運(yùn)行的收率都略低，這與等度洗脫評(píng)估的預(yù)期一致。

總體而言，這些結(jié)果表明，在傳統(tǒng)Protein A填料上用于清除宿主細(xì)胞蛋白（HCP）的常用洗滌緩沖液也能成功地去除溫和洗脫pH填料上的HCP。由于與HCP的相互作用具有分子特異性，因此需要針對(duì)每種目標(biāo)蛋白確定最佳的洗滌緩沖液。pH低于7.0的洗滌緩沖液可能有助于提高HCP去除率，但通常會(huì)以降低收率或上樣密度為代價(jià)，因?yàn)樵谶@些洗滌條件下，蛋白質(zhì)可能會(huì)被部分洗脫。

在優(yōu)化條件下純化澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物

對(duì)澄清的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物進(jìn)行純化，以評(píng)估與傳統(tǒng)填料相比，溫和洗脫pH Protein A層析填料在最佳條件下對(duì)Fc1和mAb1的選擇性純化能力。Fc1在HipH-002上進(jìn)行純化，洗脫pH設(shè)定為5.2；mAb1則在Jetted A50 HipH上進(jìn)行純化，洗脫pH設(shè)定為4.4。將這些經(jīng)過(guò)優(yōu)化的溫和洗脫運(yùn)行結(jié)果與在Jetted A50和MabSelect SuRe上、洗脫pH為3.5的純化運(yùn)行結(jié)果進(jìn)行比較。所有Fc1的運(yùn)行過(guò)程中均加入了50 mM辛酸鈉和1 M精氨酸（pH 7.0）的中間HCP洗滌液；所有mAb1的運(yùn)行過(guò)程中均加入了0.5 M精氨酸（pH 7.0）。

表7總結(jié)了在最佳溫和洗脫pH填料上純化后洗脫液的工藝性能和產(chǎn)物質(zhì)量，并將其與兩種傳統(tǒng)Protein A填料進(jìn)行了比較。對(duì)于Fc1，HipH-002上的收率與兩種傳統(tǒng)Protein A填料相當(dāng)，后者的洗脫液中HMW水平較低。這是因?yàn)镠ipH-002上的洗脫pH更高，且柱上HMW物質(zhì)與單體的分離效果更好。使用pH 5.2的洗脫緩沖液時(shí)，洗脫pH低于梯度實(shí)驗(yàn)中UV峰最大值出現(xiàn)的pH（pH 5.7），從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的高回收率。pH 5.2也高于發(fā)生50% HMW去除的pH（pH 5.0），這表明在該洗脫pH下，大部分HMW仍然與柱結(jié)合，從而在Protein A步驟中更有效地去除了HMW。此外，與傳統(tǒng)Protein A填料相比，HipH-002的HCP清除率相當(dāng)。

表7. 細(xì)胞培養(yǎng)收獲物純化的工藝性能和洗脫產(chǎn)物質(zhì)量。

對(duì)于mAb1，在Jetted A50 HipH上的收率相較于傳統(tǒng)Protein A填料大約低了10%。在此次使用細(xì)胞培養(yǎng)材料作為上樣的運(yùn)行中，觀察到洗滌步驟中存在收率損失，推測(cè)這可能是由于分子與配基之間的結(jié)合強(qiáng)度減弱所致。而當(dāng)使用Protein A洗脫液作為上樣材料時(shí)，在相同的洗滌和洗脫條件下，洗滌步驟中的收率損失最小。這表明，使用細(xì)胞培養(yǎng)材料而非純化蛋白作為上樣的等度洗脫和洗滌評(píng)估實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)對(duì)收率方面的最佳洗滌和洗脫緩沖液選擇得出不同的結(jié)論。此外，由于洗脫pH緩沖液較為溫和，Jetted A50 HipH上的洗脫液峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致峰收集不完整，從而使得收率較低。采用pH稍低的洗脫緩沖液或增加洗脫體積可以提高回收率。相比之下，Jetted A50或MabSelect SuRe在中間洗滌中沒(méi)有損失，其洗脫峰非常尖銳。與Fc1類似，Jetted A50 HipH的洗脫pH值較高（4.4），有助于提高HMW清除率，使得結(jié)合力更強(qiáng)的HMW物質(zhì)留在柱上。Jetted A50 HipH上的HCP清除率也與傳統(tǒng)Protein A填料相當(dāng)。

表7僅展示了使用最溫和洗脫pH的最佳HipH填料的結(jié)果，以凸顯其優(yōu)勢(shì)。此外，還使用與最佳HipH填料相同的洗脫和洗滌緩沖液，在Jetted A50上對(duì)Fc1進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)純化，在HipH-002上對(duì)mAb1進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)純化，結(jié)果表明HipH填料能夠在比傳統(tǒng)Protein A填料更溫和的pH條件下實(shí)現(xiàn)洗脫，同時(shí)有效去除HMW和HCP雜質(zhì)。然而，與HipH-002相比，Jetted A50 HipH上使用Fc1的收率略低；與Jetted A50相比，在HipH-002上使用mAb1的產(chǎn)量略低，這與等度洗脫評(píng)估的預(yù)期一致。因此，需要針對(duì)每種目標(biāo)蛋白質(zhì)和每種填料確定最佳的緩沖液和運(yùn)行條件，以在收率、雜質(zhì)去除和洗脫液pH（如有必要）之間取得最佳平衡。

Protein A層析通常不用于去除高分子量（HMW）雜質(zhì)，因?yàn)槭杷嗷プ饔脤游觯℉IC）和陽(yáng)離子交換層析（CEX）等模式在這方面更為有效。然而，在工藝早期去除雜質(zhì)有助于減輕后續(xù)精純步驟的負(fù)擔(dān)，從而實(shí)現(xiàn)更高的上樣量和提高收率。盡管已有研究證明Protein A層析能夠分離HMW和單體，但所需條件往往導(dǎo)致收率不理想或需要添加鹽。由于回收率低或與后續(xù)步驟的工藝連接困難，這兩種選擇對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來(lái)說(shuō)都是不理想或不可行的。使用標(biāo)準(zhǔn)Protein A方案，HipH填料能夠顯著降低HMW含量并獲得可接受的收率，只需改變洗脫pH值即可。

洗脫pH對(duì)pH敏感分子的影響

在上一節(jié)中討論的HipH-002、Jetted A50和MabSelect SuRe細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)行中，天然Fc1洗脫物的穩(wěn)定性在48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行了評(píng)估。HipH-002使用pH 5.2的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，而Jetted A50和MabSelect SuRe則使用pH 3.5的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。

表7展示了洗脫完成后10分鐘內(nèi)測(cè)定的Fc1天然洗脫液的pH值和洗脫液中的HMW水平。從圖5可以看出，與HipH-002相比，Jetted A50和MabSelect SuRe的天然洗脫液起始HMW水平更高。這可能是由于在柱上發(fā)生或快速聚集和HMW分離的結(jié)合所致。已知Fc1在pH低于4.5時(shí)不穩(wěn)定。因此，在Jetted A50和MabSelect SuRe上使用低pH洗脫可能會(huì)導(dǎo)致在柱洗脫時(shí)以及收集的洗脫液中發(fā)生聚集，因?yàn)樘烊幌疵撘旱膒H值分別為3.7和3.9。此外，由于HMW與柱的結(jié)合更強(qiáng)，與傳統(tǒng)Protein A填料（將HMW與產(chǎn)物一起洗脫）所需的低pH值洗脫相比，HipH-002上較溫和的pH值洗脫可以選擇性地洗脫產(chǎn)物，而保持HMW結(jié)合。傳統(tǒng)的Protein A洗脫液在低pH下48小時(shí)內(nèi)不穩(wěn)定，Jetted A50洗脫液的HMW從4.9%增加到9.1%，MabSelect SuRe洗脫液的HMW從8.3%增加到16.4%。相比之下，天然HipH-002洗脫液的pH高于4.5，HMW水平在48小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。由于HipH填料可以用較溫和的洗脫pH洗脫，因此Protein A洗脫液的純度和穩(wěn)定性都有所提高。

圖 5.天然 Fc1 Protein A 洗脫物的穩(wěn)定性。使用 HipH-002、Jetted A50 和 MabSelect SuRe 在優(yōu)化條件下從澄清細(xì)胞培養(yǎng)液中純化后 48 小時(shí)內(nèi)天然 Fc1 Protein A 洗脫物的 HMW 水平比較。

Jetted A50 HipH 實(shí)施注意事項(xiàng)

為了加速工藝開發(fā)進(jìn)程，公司通常采用適用于大多數(shù)產(chǎn)物的平臺(tái)工藝。借助易于理解和模板化的工藝，可以大幅減少時(shí)間和資源投入，其中每個(gè)分子僅需優(yōu)化少數(shù)參數(shù)。Protein A層析通常是平臺(tái)工藝中的首個(gè)層析步驟，因?yàn)樗軌蜻x擇性地捕獲和濃縮細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)物。然而，對(duì)于那些在低pH下容易聚集的復(fù)雜蛋白質(zhì)（如某些非典型單克隆抗體），它們可能無(wú)法很好地適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的平臺(tái)工藝，從而迫使工藝偏離既定流程，并顯著增加工藝開發(fā)時(shí)間。Jetted A50 HipH作為平臺(tái)Protein A填料的主要候選者，其優(yōu)勢(shì)在于能夠適用于任何含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)，無(wú)論其對(duì)低pH的敏感性如何，并且只需對(duì)上樣、洗脫和洗脫階段的緩沖液及體積進(jìn)行優(yōu)化。溫和的洗脫pH運(yùn)行條件帶來(lái)了更寬廣的操作范圍，但與傳統(tǒng)Protein A填料通常呈現(xiàn)的尖銳且濃縮的洗脫液峰相比，可能會(huì)出現(xiàn)洗脫峰拖尾和洗脫液收集量增加的情況。在確定最優(yōu)操作條件時(shí)，需要權(quán)衡收率、HMW清除率、天然洗脫液pH和洗脫體積等因素，以實(shí)現(xiàn)最佳性能和收率的平衡。相較于使用傳統(tǒng)Protein A填料，這可能會(huì)略微增加該P(yáng)rotein A步驟的開發(fā)時(shí)間，但從純度角度來(lái)看是有益的。Jetted A50 HipH可以輕松替代平臺(tái)工藝中現(xiàn)有的Protein A填料，并與現(xiàn)有的下游工藝無(wú)縫集成。

Protein A填料（包括Jetted A50 HipH）面臨的主要挑戰(zhàn)之一是其壽命和可清潔性，而填料的高成本使得這一問(wèn)題更加突出。收率和結(jié)合載量的下降通常歸因于在清潔過(guò)程中填料暴露于堿性條件下導(dǎo)致的配基水解，以及雜質(zhì)的積累導(dǎo)致填料污染。本研究未對(duì)填料循環(huán)進(jìn)行評(píng)估。供應(yīng)商聲稱，Jetted A50 HipH在暴露于0.1 M氫氧化鈉120小時(shí)后仍能保持出色的載量（>85%初始動(dòng)態(tài)結(jié)合載量，DBC）。這與MabSelect SuRe LX相比要低得多，后者在配基水解研究中，填料在暴露于0.1 M氫氧化鈉約250小時(shí)后仍能保持容量（>85%初始DBC）。填料壽命與成本直接相關(guān)，因?yàn)樘盍系某杀究梢栽诟鱾€(gè)循環(huán)中分?jǐn)?，填料壽命越短，每個(gè)循環(huán)的填料成本就越高。在填料壽命研究中，必須同時(shí)評(píng)估填料污染和配基水解，以評(píng)估在代表性工藝條件下的填料循環(huán)，因?yàn)殡s質(zhì)可以非特異性地與填料結(jié)合，阻礙與配基的接觸。與僅評(píng)估配基水解的研究相比，同時(shí)評(píng)估污染和配基水解的填料壽命研究觀察到載量和收率下降得更快、更嚴(yán)重，這表明與配基水解相比，填料污染在降低結(jié)合載量方面起著更重要的作用。然而，填料污染和配基水解的速率取決于細(xì)胞培養(yǎng)基、堿再生溶液和每個(gè)循環(huán)的接觸時(shí)間。因此，需要對(duì)每個(gè)分子和填料進(jìn)行完整的柱循環(huán)研究，以確定在代表性工藝條件下的填料壽命。

結(jié)論

與傳統(tǒng)的Protein A填料Jetted A50和MabSelect SuRe相比，兩種溫和洗脫pH的Protein A填料Jetted A50 HipH和原型HipH-002成功地在較溫和的pH條件下洗脫了6種分子。新商業(yè)化的Jetted A50 HipH填料展現(xiàn)出更廣泛的溫和洗脫特性，大多數(shù)評(píng)估的蛋白質(zhì)的洗脫pH達(dá)到4.6或更高，預(yù)計(jì)能夠在比傳統(tǒng)Protein A填料更溫和的pH下成功洗脫所有含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)。HipH填料不僅具有與傳統(tǒng)Protein A填料相當(dāng)?shù)母呓Y(jié)合載量和回收率，還表現(xiàn)出使用典型清洗去除雜質(zhì)的能力，從而可以無(wú)縫集成到傳統(tǒng)的Protein A純化平臺(tái)工藝中。對(duì)于那些在低pH下不穩(wěn)定而無(wú)法使用傳統(tǒng)Protein A層析的蛋白質(zhì)，這項(xiàng)技術(shù)將帶來(lái)極大的益處，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可以在溫和的pH下洗脫，避免暴露于低pH條件。在溫和pH下洗脫的能力將避免在洗脫緩沖液中使用改性劑或直接中和，從而實(shí)現(xiàn)更好的工藝連接和設(shè)備適配，并且所需的生產(chǎn)控制不那么嚴(yán)格。對(duì)于所有蛋白質(zhì)，即使在低pH下穩(wěn)定，HipH填料也能提供更寬的操作窗口，這可以顯著改善HMW雜質(zhì)的去除，減輕后續(xù)精純步驟的雜質(zhì)負(fù)擔(dān)。對(duì)于那些希望使用熟悉的Protein A工藝，并且能夠靈活地兼容所有含F(xiàn)c蛋白質(zhì)（無(wú)論是不穩(wěn)定的還是穩(wěn)定的）的填料的人來(lái)說(shuō)，Jetted A50 HipH是平臺(tái)Protein A層析填料的理想選擇。

參考資料：

F.A.S.Wang, Y.Fan, W.K.Chung, et al., Evaluation of mild pH elution protein A resins for antibodies and Fc-fusion proteins. Journal of Chromatography A, 2024.