摘要：在生物制造領域，工藝強化就像是一把神奇的鑰匙，能打開提高生產(chǎn)效率、降低成本的寶藏大門。今天就來給大家講講一個真實的案例，看看中國倉鼠卵巢細胞系生產(chǎn)單克隆抗體的工藝，是怎么從傳統(tǒng)的老方法一步步升級，變成更厲害的強化工藝的。
過去 30 年，用哺乳動物細胞培養(yǎng)來做生物制造，取得了很大的進步。以前生產(chǎn)出來的東西濃度很低，只有 mg/L，現(xiàn)在能達到 g/L 了，成本也跟著大幅下降。這主要靠優(yōu)化細胞系、開發(fā)更好的細胞培養(yǎng)基，還有調(diào)整生物反應器的參數(shù)這些方法。不過，在提高產(chǎn)量的同時，產(chǎn)品質(zhì)量也得保證。
可現(xiàn)在生物制造業(yè)還是面臨著大挑戰(zhàn)，提高生產(chǎn)率和產(chǎn)量依舊是大家頭疼的難題。為了降低成本，學術界和企業(yè)都在研究怎么通過連續(xù)或半連續(xù)生物制造，把工藝強化一下。
工藝強化，簡單來說，就是用一些創(chuàng)新的技術和方法，讓生產(chǎn)過程變得更好，像提高生產(chǎn)率，還能減少制造成本和工廠的占地面積。在化學工業(yè)里，工藝強化早就成功應用了，效果特別好。但生物制造業(yè)不一樣，它監(jiān)管很嚴格，而且是用活的生物體生產(chǎn)昂貴的生物制劑，產(chǎn)量還比較小。就拿灌注細胞培養(yǎng)來說，要不停地加新鮮培養(yǎng)基，去掉用過的培養(yǎng)基，還得用專門的設備把細胞留在生物反應器里，操作起來特別復雜。所以在生產(chǎn)單克隆抗體這類蛋白質(zhì)的時候，灌注細胞培養(yǎng)還沒有被廣泛使用。不過，要是生產(chǎn)那些不穩(wěn)定、濃度又低的蛋白質(zhì)，灌注細胞培養(yǎng)就很有用，能讓生產(chǎn)率提高不少。
最近，在補料分批生產(chǎn)加工里強化 N-1 種子培養(yǎng)，取得了很大進展。以前傳統(tǒng)的補料分批培養(yǎng)，接種密度比較低，現(xiàn)在通過 N-1 灌注接種，接種密度能大大增加。這樣一來，在更短的時間里，就能達到和傳統(tǒng)工藝差不多的最終濃度，工廠的產(chǎn)量也就提高了。而且這種方法不需要對現(xiàn)有的制造設備做太大改動，所以在生物制藥行業(yè)用得很廣泛。就算不用灌注的 N-1 種子，用富集培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的 N-1 種子，也能達到類似的效果，操作還更簡單。
再看看下游工藝，雖然也有一些進步，比如蛋白 A 層析的裝載能力提高了，純化色譜步驟也有改進，但隨著上游產(chǎn)量大幅增加，下游操作還是拖了后腿，成了提高生產(chǎn)效率的瓶頸，而且成本也很高。所以現(xiàn)在大家都在想辦法強化下游工藝，像用連續(xù)色譜技術，還有連續(xù)病毒滅活和過濾這些方法。
在這個案例里，研究人員比較了三種生產(chǎn)單克隆抗體的生物制造工藝。工藝 A 是傳統(tǒng)的間歇工藝，工藝 B 和 C 是強化工藝。在工藝的上游部分，研究人員對 N-1 灌注進行了開發(fā)，讓補料批的濃度大幅提高；在下游部分，采用了兩個柱的 MCC 蛋白 A 捕獲技術，還有集成拋光步驟，讓下游的生產(chǎn)效率大大提升。同時，還對不同工藝的最終原料藥和消耗品成本進行了分析和比較。
上游工藝大變化，產(chǎn)量質(zhì)量雙提升
從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C，上游有很多地方都變了。像細胞系、基礎和進料培養(yǎng)基不一樣了，N-2 和 N-1 種子培養(yǎng)的條件，還有補料分批生產(chǎn)生物反應器的條件，像接種密度、進料情況、溫度等都有變化。
不同的 N-2 種子培養(yǎng)條件，最后得到的活細胞密度也不一樣。工藝 A、B、C 的 N-2 最終活細胞密度各不相同。用這些 N-2 種子去接種 N-1 種子生物反應器，接種密度也不一樣。而且 N-1 步驟的最終活細胞密度，從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C 是越來越高的。雖然工藝 C 在 N-1 種子階段的細胞存活率最后有點下降，但對后面的補料分批生產(chǎn)培養(yǎng)沒什么不好的影響。
到了補料分批生產(chǎn)階段，工藝 A、B、C 的初始接種密度也是逐漸增加的。細胞密度在培養(yǎng)過程中的變化也不一樣，工藝 C 的峰值細胞密度和最終細胞密度都是最高的。細胞存活率方面，工藝 B 和 C 一直都保持得很好，工藝 A 到后期就比較低了。
再看看產(chǎn)量，從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C，最終標準化滴度越來越高，細胞比生產(chǎn)率也是工藝 C 最高。這主要是因為接種密度大幅增加，還有細胞系、培養(yǎng)基、生物反應器操作等方面的優(yōu)化。而且，工藝 B 和 C 在培養(yǎng)過程中，沒有出現(xiàn)什么大的放大問題，一些代謝物和滲透壓濃度都控制得很好，比工藝 A 強多了。
下游工藝新變革，效率提升成本降
下游工藝從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C，變化主要體現(xiàn)在三個色譜步驟的操作條件，還有最終配制的原料藥蛋白濃度上。
蛋白 A 步驟，工藝 A 用的樹脂負載能力有限，工藝 B 的樹脂負載能力提高了，工藝 C 采用新的模式，負載能力更高。AEX 步驟，三種工藝都用了流通模式，但工藝 B 和 C 的樹脂負載能力比工藝 A 高很多。CEX 步驟，工藝 A 是結(jié)合 - 洗脫模式，工藝 B 和 C 是流通模式，負載能力也增加了不少。而且，工藝 C 還采用了集成 AEX - CEX 操作，最終配制的原料藥濃度也提高了。
這些變化帶來了很多好處。從工藝 B 到工藝 C，生產(chǎn)率提高了，樹脂利用率也高了，緩沖液消耗減少，樹脂體積變小，處理時間還縮短了。雖然工藝 C 的下游收率一開始比工藝 A 和 B 略低，但這是因為新設施啟動時操作上有些問題，調(diào)整之后就能達到和其他工藝相當?shù)乃健?/p>
在去除雜質(zhì)方面，不管是哪種工藝，色譜步驟都能把雜質(zhì)去除到可接受的水平。工藝 B 和 C 在最終超濾 / 滲濾步驟的雜質(zhì)水平還更低一些。
最終產(chǎn)品質(zhì)量好，成本大幅降低
在產(chǎn)品質(zhì)量方面，工藝 B 和 C 的電荷均勻性比工藝 A 好。N - 連接聚糖方面，雖然不同工藝有些差異，但這些差異對產(chǎn)品質(zhì)量影響不大。工藝 B 和 C 的產(chǎn)品純度更高，不過從單體值來看，三種工藝又比較相似。酶聯(lián)免疫吸附試驗測定的效力，三種工藝也差不多。而且，三種工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品里，雜質(zhì)含量都很低，符合驗收標準。
在成本方面，研究人員對三種工藝進行了 COG 分析，只考慮了消耗品成本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C，上游和下游的成本都大幅減少，特別是從工藝 A 到工藝 B，變化最明顯。上游成本降低主要是因為滴度提高、培養(yǎng)基成本下降；下游成本降低是因為上游滴度增加、色譜過程優(yōu)化等。而且，對于不同的生產(chǎn)規(guī)模，上游和下游成本的比例也不一樣。
總結(jié)
這個案例成功展示了在 2000L 規(guī)模上，混合強化生物制造工藝（工藝 C）生產(chǎn)單克隆抗體的全過程。通過強化上游的 N-1 種子培養(yǎng)，還有優(yōu)化下游的色譜操作，不僅提高了上游的滴度和下游的生產(chǎn)率，還保證了產(chǎn)品質(zhì)量。而且，強化工藝很穩(wěn)定，在臨床制造中也能成功擴大規(guī)模，成本還降低了不少。這為生物制造未來的發(fā)展，提供了一個很好的范例。
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