貼壁細(xì)胞向懸浮細(xì)胞的馴化是生物制藥領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分、調(diào)整培養(yǎng)條件及采用特定馴化策略，可顯著縮短馴化周期并提高細(xì)胞活率和穩(wěn)定性。以下從馴化方法、關(guān)鍵技術(shù)、影響因素及挑戰(zhàn)等方面進(jìn)行系統(tǒng)闡述。
一、貼壁細(xì)胞馴化的必要性
貼壁細(xì)胞（如HEK293、CHO等）在傳統(tǒng)培養(yǎng)中依賴(lài)血清和貼壁表面，但血清成本高、批次差異大，且貼壁工藝難以規(guī)?；腋∨囵B(yǎng)則具有無(wú)血清、成分明確、易放大等優(yōu)勢(shì)，適用于生物反應(yīng)器生產(chǎn)病毒載體、單克隆抗體等生物制品。
二、主要馴化方法及步驟
1.梯度降血清結(jié)合懸浮馴化法
步驟：
● 初始復(fù)蘇：使用含10%血清的培養(yǎng)基（如DMEM/F12）恢復(fù)細(xì)胞活性，傳代至穩(wěn)定。
● 逐步降血清：將細(xì)胞依次轉(zhuǎn)移至含血清梯度（如5%、3%、2%、1%）的混合培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度傳代1-3次，同時(shí)引入搖瓶懸浮培養(yǎng)。
● 無(wú)血清適應(yīng)：最終過(guò)渡至無(wú)血清培養(yǎng)基，通過(guò)半量換液法維持細(xì)胞密度（如3-10×10? cells/ml）和代謝活性。
優(yōu)勢(shì)：馴化周期縮短至1個(gè)月內(nèi)，細(xì)胞分散性好，活率高。
2.無(wú)血清快速馴化法
步驟：
● 單克隆篩選：通過(guò)有限稀釋法篩選生長(zhǎng)快、轉(zhuǎn)染效率高的單克隆細(xì)胞。
● 肝素鈉輔助馴化：在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加肝素鈉（終濃度100-300 U/mL），抑制細(xì)胞聚集，結(jié)合耐CO?搖床培養(yǎng)（80 rpm，37℃）加速適應(yīng)懸浮環(huán)境。
● 動(dòng)態(tài)傳代：每天或隔天傳代，逐步降低肝素鈉濃度，直至細(xì)胞完全適應(yīng)無(wú)血清懸浮狀態(tài)。
優(yōu)勢(shì)：周期僅需數(shù)周，適用于HEK293T等易結(jié)團(tuán)細(xì)胞。
3.直接懸浮馴化法
● 步驟：將消化后的貼壁細(xì)胞直接接種至無(wú)血清培養(yǎng)基中，通過(guò)離心沉降、轉(zhuǎn)瓶/搖瓶培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速110-140 rpm）及多次傳代（5次以上）篩選懸浮細(xì)胞亞群。
● 關(guān)鍵調(diào)整：降低培養(yǎng)基中鈣、鎂離子濃度以減少聚集，添加抗結(jié)團(tuán)劑（如Pluronic F-68）和泡沫抑制劑。
三、關(guān)鍵技術(shù)及優(yōu)化策略
1.培養(yǎng)基優(yōu)化
● 無(wú)血清培養(yǎng)基設(shè)計(jì)：需補(bǔ)充胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂類(lèi)等關(guān)鍵成分，替代血清功能。
● 添加劑應(yīng)用：肝素鈉、聚乙烯醇（PVA）等可改善細(xì)胞分散性；抗氧化劑（如谷胱甘肽）減少氧化應(yīng)激。
2.培養(yǎng)條件調(diào)控
● 物理參數(shù)：搖床轉(zhuǎn)速（80-140 rpm）、溶氧（30%-60%）、pH（6.8-7.2）需逐步優(yōu)化以維持細(xì)胞代謝平衡。
● 溫度與CO?：通常為37℃、5% CO?，但部分細(xì)胞需適應(yīng)低CO?環(huán)境以提高懸浮穩(wěn)定性
3.細(xì)胞系選擇與單克隆篩選
● 適用細(xì)胞類(lèi)型：HEK293、CHO、BHK21等貼壁依賴(lài)性較弱的細(xì)胞更易馴化。
● 單克隆優(yōu)勢(shì)：篩選高生長(zhǎng)速率、低結(jié)團(tuán)率的克隆可提升馴化成功率。
四、挑戰(zhàn)與解決方案
1.細(xì)胞結(jié)團(tuán)問(wèn)題
● 成因：細(xì)胞間黏附分子（如鈣黏蛋白）過(guò)度表達(dá)或代謝廢物積累。
● 對(duì)策：添加肝素鈉、調(diào)整培養(yǎng)基離子濃度，或通過(guò)機(jī)械攪拌（如磁力攪拌子）物理分散。
2.馴化周期長(zhǎng)
● 傳統(tǒng)瓶頸：梯度降血清法需數(shù)月時(shí)間。
● 創(chuàng)新方案：結(jié)合單克隆篩選與直接懸浮馴化，可將周期壓縮至4-6周。
3.遺傳穩(wěn)定性
● 風(fēng)險(xiǎn)：長(zhǎng)期傳代可能導(dǎo)致染色體變異或功能丟失。
● 監(jiān)控措施：定期檢測(cè)細(xì)胞核型、產(chǎn)物表達(dá)一致性及支原體污染。
五、應(yīng)用與前景
懸浮馴化技術(shù)已成功應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞治療中的慢病毒載體生產(chǎn)、重組蛋白表達(dá)等領(lǐng)域。未來(lái)趨勢(shì)包括：
● 自動(dòng)化馴化平臺(tái)：結(jié)合生物反應(yīng)器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與AI算法優(yōu)化參數(shù)。
● 個(gè)性化培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)：針對(duì)不同細(xì)胞系設(shè)計(jì)化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基，進(jìn)一步提升產(chǎn)物效價(jià)。
結(jié)語(yǔ)
貼壁細(xì)胞向懸浮細(xì)胞的馴化是生物工藝從實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)化的核心環(huán)節(jié)。通過(guò)綜合應(yīng)用梯度降血清、單克隆篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化等策略，可高效獲得適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系，為生物制藥的規(guī)?；a(chǎn)提供可靠基礎(chǔ)。未來(lái)需進(jìn)一步解決細(xì)胞結(jié)團(tuán)、遺傳穩(wěn)定性等問(wèn)題，推動(dòng)技術(shù)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用深度融合。
合作咨詢(xún)
肖女士
021-33392297
Kelly.Xiao@imsinoexpo.com
2006-2025 上海博華國(guó)際展覽有限公司版權(quán)所有（保留一切權(quán)利）
滬ICP備05034851號(hào)-57
