強制降解研究的目的
強制降解研究在單克隆抗體治療藥物的整個生命周期中被廣泛用于支持多種目標（表1）。監(jiān)管機構也期望通過強制降解研究理解產品的降解途徑，并建立穩(wěn)定性指示方法以監(jiān)測保質期內可能發(fā)生的降解。此外，強制降解研究常用于評估可生產性、方法開發(fā)與驗證、關鍵質量屬性（CQA）評價以及產品變體的識別。
表1. 強制降解研究的目的與依據
常見強制降解條件下的主要降解途徑
常用強制降解條件包括高溫、凍融、振蕩、高pH、低pH、光照、氧化和糖化。這些條件雖嚴苛于實際儲存條件，但可在短時間內生成相關降解產物。主要降解途徑總結如圖1。
圖1. 重組單克隆抗體的主要降解
途徑箭頭表示主要降解位點，括號內為常用檢測方法。
高溫
高溫加速多種降解途徑，包括聚集（共價或非共價）、肽鍵斷裂（如鉸鏈區(qū)裂解）、天冬酰胺（Asn）脫酰胺化、甲硫氨酸氧化等。例如，中性或弱堿性條件下，高溫會通過β-消除導致二硫鍵降解，形成硫醚鍵交聯(lián)的不可逆聚集體。
凍融
凍融主要導致聚集體的形成（如二聚體和多聚體），其程度受pH、緩沖液濃度、鹽分和蛋白濃度影響?；瘜W降解在此條件下較少發(fā)生。
振蕩
振蕩通過增加抗體與疏水界面（如氣液界面）接觸，導致共價或非共價聚集。非天然二硫鍵的形成是共價聚集的主要原因，其程度受pH、鹽分、表面活性劑（如聚山梨酯）等因素調控。
低pH
低pH（如純化過程中的Protein A洗脫條件）誘導聚集、肽鍵斷裂（如鉸鏈區(qū)裂解）和天冬氨酸異構化。天冬氨酸異構化會生成中間體琥珀酰亞胺，并導致酸性物種增加。
高pH
高pH條件下，天冬酰胺脫酰胺化（如Fc段的“PNNY”肽段）成為標志性降解途徑，同時加速聚集和肽鍵水解。此外，高pH可能引發(fā)二硫鍵重排，形成硫醚鍵或游離巰基。
光穩(wěn)定性
光照主要導致色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸氧化，并引發(fā)共價聚集。光氧化具有位點選擇性，例如甲硫氨酸氧化傾向于同一重鏈，而化學氧化則隨機分布。
氧化
氧化劑（如過氧化氫）主要導致甲硫氨酸氧化為甲硫氨酸亞砜或砜，其中CH2域的Met252和CH3域的Met428因表面暴露度高而最易被氧化。氧化還可能引發(fā)聚集和構象變化。
糖化
糖化是還原糖與抗體賴氨酸側鏈或N端氨基的非酶促反應，導致分子量增加162 Da。糖化水平受溫度、pH、糖濃度等因素影響，可能影響抗體結合活性或誘導聚集。
強制降解研究的應用
預篩選
預篩選旨在確定能產生有意義降解水平的條件。常用方法包括尺寸排阻色譜（SEC）檢測聚集、陽離子交換色譜（CEX）檢測電荷變化以及液相色譜-質譜（LC-MS）鑒定氧化或糖化位點。
表2. 推薦的預篩選條件與方法
應用領域
強制降解研究貫穿藥物開發(fā)生命周期（表3），包括候選分子篩選、配方開發(fā)、方法驗證、雜質鑒定、可比性評估等。例如，在可比性研究中，強制降解可揭示常規(guī)分析無法檢測的差異，確保工藝變更后產品質量一致。
表3. 強制降解研究在mAb生命周期中的應用
監(jiān)管指導方針
強制降解相關要求分散于多個ICH、FDA和EMA文件中（表4）。例如，ICH Q5C強調需通過極端條件理解降解途徑，ICH Q1B規(guī)范了光穩(wěn)定性測試，而ICH Q5E則支持可比性研究中的數據應用。
表4. 相關監(jiān)管指導文件
結論
強制降解研究是重組單克隆抗體開發(fā)中的關鍵工具，貫穿從早期候選篩選到上市后可比性評估的全過程。通過合理設計實驗條件，可深入理解抗體的生化特性，支持配方優(yōu)化、方法驗證和監(jiān)管申報。未來，隨著生物類似藥和復雜抗體療法的興起，強制降解研究的重要性將進一步凸顯。
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