線粒體，被稱為細(xì)胞的“能量工廠”，其內(nèi)部的 DNA（mtDNA）掌控著能量代謝的關(guān)鍵基因。mtDNA 的突變會引發(fā)多種嚴(yán)重遺傳病，例如 Leigh綜合征、MELAS 綜合征等。然而，傳統(tǒng)的 CRISPR 基因編輯工具難以編輯線粒體 DNA，科學(xué)家們一直在尋找突破。
2025年3月25日，上海科技大學(xué)陳佳團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology期刊發(fā)表了題為：Leveraging base excision repair for efficient adenine base editing of mitochondrial DNA的研究論文，帶來了線粒體基因編輯的“超能武器”。
該研究揭示了線粒體 DNA 腺嘌呤堿基編輯器TALED的工作機(jī)制，并進(jìn)一步開發(fā)出了一系列增強(qiáng)型工具——eTALED6，顯著提升了線粒體基因編輯的效率與精準(zhǔn)度，為線粒體疾病建模和治療提供了新工具。
線粒體DNA編輯的世紀(jì)難題
線粒體疾病影響著全球 1/5000 的新生兒，患者因線粒體 DNA（mtDNA）上的 A-to-G 或C-to-T 堿基替換導(dǎo)致能量代謝崩潰。盡管 CRISPR 基因編輯技術(shù)已趨于成熟，但線粒體的特殊結(jié)構(gòu)讓其束手無策：向?qū)?RNA（gRNA）無法穿透線粒體膜，且線粒體 DNA 的超螺旋結(jié)構(gòu)難以解旋。
2020 年 7 月，劉如謙團(tuán)隊(duì)在Nature期刊發(fā)表論文【2】，開發(fā)了一種不依賴 CRISPR 的堿基編輯器——DdCBE，能夠?qū)崿F(xiàn)對線粒體 DNA 的精準(zhǔn)編輯，為研究線粒體遺傳病和治療線粒體遺傳病帶來了全新工具，但這一工具也有其局限性，只能對線粒體 DNA進(jìn)行C-to-T堿基轉(zhuǎn)換。
2022年4月，韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究院金鎮(zhèn)秀團(tuán)隊(duì)在Cell發(fā)表論文【3】，開發(fā)了一種新型線粒體堿基編輯平臺——TALED（轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物連接的脫氨酶），首次實(shí)現(xiàn)了在線粒體 DNA 的A-to-G堿基轉(zhuǎn)換，大大擴(kuò)展了線粒體基因編輯的范圍。
TALED 通過融合 TALE 蛋白、雙鏈 DNA 脫氨酶 DddA 以及單鏈脫氨酶 TadA8e，首次實(shí)現(xiàn)了對線粒體 DNA 的 A-to-G 堿基編輯。然而，謎團(tuán)仍未解開——這種編輯究竟如何發(fā)生？為何效率有限？
破解TALED的編輯機(jī)制
在這項(xiàng)最新研究中，陳佳團(tuán)隊(duì)通過一系列精巧實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了TALED 并非直接在雙鏈 DNA 上進(jìn)行 A-to-G 編輯，而是依賴 DddA 誘導(dǎo) C-to-U 的脫氨反應(yīng)，觸發(fā)線粒體堿基切除修復(fù)（BER）過程，具體機(jī)制如下：
1、DddA 打頭陣：在目標(biāo)區(qū)域觸發(fā) C-to-U 脫氨，產(chǎn)生“錯(cuò)誤”的尿嘧啶（U）；
2、細(xì)胞啟動修復(fù)：尿嘧啶糖苷酶（UDG）切除 U，形成無堿基位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）；
3、DNA 鏈斷裂：AP內(nèi)切酶切割產(chǎn)生單鏈缺口，線粒體核酸酶 MGME1 進(jìn)一步擴(kuò)大缺口；
4、TadA8e 登場：單鏈區(qū)域暴露后，TadA8e 精準(zhǔn)催化 A-to-I（次黃嘌呤）編輯；
5、永久改寫：細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)將 I 識別為 G，最終實(shí)現(xiàn) A-to-G 編輯。
TALED 介導(dǎo)的 A-to-G 編輯依賴于 BER
這一發(fā)現(xiàn)顛覆了以往認(rèn)為的“DddA 通過解旋 DNA 輔助編輯”的假說，首次證明了線粒體堿基切除修復(fù)（BER）是編輯的關(guān)鍵推手。
升級版eTALED：效率與精度的雙重飛躍
基于上述編輯機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，陳佳團(tuán)隊(duì)開發(fā)了升級版TALED 編輯器——eTALED：1、動力升級：使用高活性突變體 DddA6 替換原始 DddA，編輯效率提升 3 倍；2、精準(zhǔn)導(dǎo)航：融合人源 UDG 加速修復(fù)過程，關(guān)鍵位點(diǎn)編輯效率突破 70%；3、智能降噪：改造 TadA8e 的底物識別域（V28R突變），將編輯窗口從 15bp 縮至 4bp；4、雙重保險(xiǎn)：新工具 eTALED6R 的 RNA 脫靶率降低為原來的 1/60，DNA 脫靶率僅為傳統(tǒng)工具的 1/26；
接下來，陳佳團(tuán)隊(duì)利用 eTALED6 和 eTALED6R 在線粒體基因組中模擬了與Leigh 綜合征和MELAS 綜合征相關(guān)的致病突變 m.A13514G，精準(zhǔn)度達(dá) 48.8%，且未出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性，更令人振奮的是，編輯后的細(xì)胞線粒體耗氧率顯著下降，可完美模擬疾病表型。
隨著 eTALED 的優(yōu)化，未來或?qū)?shí)現(xiàn)：單堿基水平的線粒體基因組修復(fù)；開發(fā)出多種線粒體疾病的通用治療方案；實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核 DNA 與線粒體 DNA 的協(xié)同編輯。
總的來說，該研究不僅填補(bǔ)了 TALED 編輯器的分子機(jī)制研究的空白，還在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了一系列精準(zhǔn)、高效、低脫靶性的新型線粒體腺嘌呤堿基編輯工具，這些新工具在線粒體疾病建模、遺傳修復(fù)和相關(guān)基礎(chǔ)研究中具有廣泛應(yīng)用前景。
上?？萍即髮W(xué)陳佳教授為論文通訊作者，陳佳課題組博士研究生樊煜航、許文超，中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所博士研究生高寶青為論文共同第一作者。
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