在基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域，基因替代療法已廣泛應(yīng)用于臨床。然而，如何在疾病治療過(guò)程中實(shí)現(xiàn)外源基因時(shí)空特異性地反復(fù)可逆的表達(dá)調(diào)控仍面臨挑戰(zhàn)。相較于 DNA 編輯技術(shù)造成基因序列的永久改變，RNA 編輯則可通過(guò)動(dòng)態(tài)可逆的方式調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)，這一獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使其成為極具潛力的基因治療策略。目前，基于 RNA 水平的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)主要包括以下幾類(lèi)：適配體依賴(lài)的核酸開(kāi)關(guān)、小分子誘導(dǎo)的可變剪接系統(tǒng)以及 RNA 結(jié)合蛋白響應(yīng)開(kāi)關(guān)等。這些系統(tǒng)通過(guò)調(diào)控 mRNA 的穩(wěn)定性、剪接過(guò)程或翻譯效率來(lái)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的可控調(diào)節(jié)。然而，現(xiàn)有技術(shù)主要局限于外源基因的調(diào)控，在內(nèi)源基因的精確控制方面仍存在局限性。

RNA 堿基編輯系統(tǒng)能夠在內(nèi)源和外源 RNA 中執(zhí)行精準(zhǔn)的堿基轉(zhuǎn)換從而實(shí)現(xiàn)特定基因功能的激活或者失活。腺苷 RNA 堿基編輯器因其編輯效率高，在疾病治療中極具潛力。它以腺苷脫氨酶（ADAR）為核心催化酶，將雙鏈 RNA 底物中的腺苷（A）轉(zhuǎn)換為肌苷（I），由于肌苷與鳥(niǎo)苷（G）的結(jié)構(gòu)相似，在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中它能夠與胞苷（C）配對(duì)，從而實(shí)現(xiàn) A-to-G 的堿基轉(zhuǎn)換效果。根據(jù)編輯器中 ADAR 的來(lái)源，RNA 腺苷堿基編輯器可分為兩大類(lèi)：第一類(lèi)通過(guò)招募內(nèi)源 ADAR 到靶點(diǎn)附近實(shí)現(xiàn) A-to-I 編輯，例如 LEAPER 系統(tǒng)。第二類(lèi)過(guò)表達(dá)與可靶向目標(biāo) RNA 模塊融合的 ADAR 蛋白，實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性的 A-to-I 編輯，例如，REPAIR 系統(tǒng)。這些 RNA 堿基編輯器均能在細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效編輯，但持續(xù)性表達(dá)的 ADAR 導(dǎo)致大量的脫靶編輯，造成安全隱患。

為解決這一問(wèn)題，研究者開(kāi)發(fā)了多種可調(diào)控的 RNA 編輯器。這些技術(shù)均采用持續(xù)表達(dá)完整的 ADAR 蛋白的模式，在非誘導(dǎo)條件下具有很高本底活性，難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo) RNA 的靈敏、可控的編輯。而過(guò)表達(dá) ADAR 蛋白會(huì)造成較嚴(yán)重的轉(zhuǎn)錄組脫靶效應(yīng)以及潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。因此，亟需開(kāi)發(fā)出一種調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)、更加安全、且具有高度時(shí)空特異性的 RNA 堿基編輯工具。

2025年3月31日，華東師范大學(xué)李大力團(tuán)隊(duì)、劉明耀團(tuán)隊(duì)和杜冰團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Engineering a photoactivatable A-to-I RNA base editor for gene therapy in vivo 的研究論文。

該研究開(kāi)發(fā)了一種光激活 RNA 腺苷堿基編輯器——PA-rABE，該系統(tǒng)由 mini dCas13X 和光控 Magnets 系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)的分段 ADAR2dd 蛋白組成。在藍(lán)光照射下，光敏蛋白二聚化帶動(dòng)分段 ADAR2dd 相互靠近恢復(fù)脫氨酶活性，從而實(shí)現(xiàn)時(shí)空特異性的 RNA 堿基編輯。

該研究采用的光控分段脫氨酶策略賦予 PA-rABE 高度光依賴(lài)性，不僅極大地降低了 ADAR 蛋白的轉(zhuǎn)錄組脫靶效應(yīng)，還有效地規(guī)避了過(guò)表達(dá)外源 ADAR 蛋白帶來(lái)的潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò) AAV 遞送，PA-rABE 成功修復(fù)了 B 型血友病小鼠的凝血功能，展示了其在精準(zhǔn)基因治療中的應(yīng)用潛力。

為了評(píng)估 RNA 堿基編輯效率，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了攜帶無(wú)義突變的 Gaussia 熒光素酶報(bào)告，簡(jiǎn)稱(chēng) Gluc W160X。對(duì) Gluc W160X 轉(zhuǎn)錄本上的 UAG 進(jìn)行靶向編輯可以將終止密碼子轉(zhuǎn)換為 UIG 從而在功能上恢復(fù) Gaussia 熒光素酶的活性，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的強(qiáng)度即可判斷 PA-rABE 的編輯效率。為了獲得編輯效率高且沒(méi)有泄露的 RNA 堿基編輯器，該團(tuán)隊(duì)對(duì) PA-rABE 系統(tǒng)中的 Cas 蛋白、ADAR2dd 的分段位點(diǎn)、各基因元件的相對(duì)位置、linker 序列、DR 個(gè)數(shù)及 Magnets 突變體等進(jìn)行了系統(tǒng)地優(yōu)化。研究結(jié)果表明 PA-rABE 能靈敏地響應(yīng)藍(lán)光在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)可逆性的 RNA 編輯，不僅具有高度的空間特異性，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度及時(shí)間靈敏地調(diào)控編輯活動(dòng)的強(qiáng)弱。

圖1. PA-rABE系統(tǒng)的工作原理及特點(diǎn)表征

與非誘導(dǎo)的 RNA 堿基系統(tǒng)相比，PA-rABE 系統(tǒng)能高效地編輯內(nèi)源 RNA，在 10 個(gè)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本中的平均編輯率為 34.7%，高于 mxABE（~18.3%）和 REPAIRv2（~23.6%），且在轉(zhuǎn)錄組水平具有高度特異性。光照條件下，其編輯效率是近期報(bào)道的光激活 RNA 堿基編輯器 padCas13 的 2.1 倍，轉(zhuǎn)錄組水平的脫靶事件僅為 padCas13 編輯器的 2%。由此可見(jiàn)，光控分段 ADAR 策略不僅沒(méi)有削弱脫氨酶活性，還通過(guò)光調(diào)控實(shí)現(xiàn)了對(duì)脫氨酶活性的嚴(yán)格監(jiān)管，極大地降低了脫靶效應(yīng)。此外，PA-rABE 聯(lián)合特定的 crRNA 能有效地將單個(gè)或連續(xù)的雙腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷，為含有提前終止密碼子的遺傳疾病提供了一種新的治療方法。

為了探究 PA-rABE 在動(dòng)物體內(nèi)的編輯效率，該團(tuán)隊(duì)利用 PA-rABE 靶向外源 Fluc W426X 報(bào)告。該報(bào)告是一個(gè)失活的熒光素酶突變體，A-to-I 堿基轉(zhuǎn)換可以使 Fluc W426X 的終止密碼子 UAG 通讀為 UIG ，從而在功能上恢復(fù)熒光素酶活性?；铙w成像結(jié)果表明，PA-rABE 在光照條件下修復(fù) Fluc W426X 產(chǎn)生的總熒光素酶強(qiáng)度是其在黑暗條件下總強(qiáng)度的 66 倍，是 padCas13 編輯器在光照下的 17.5 倍，證明了 PA-rABE 可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐庠?nbsp;RNA 編輯。

為了進(jìn)一步探究 PA-rABE 能否在體內(nèi)編輯內(nèi)源RNA，研究團(tuán)隊(duì)將 minicircle 編碼的 PA-rABE 和 β-catenin 驅(qū)動(dòng)表達(dá)的報(bào)告（TCF/LEF-Fluc）一起注射到小鼠體內(nèi)。光照條件下，PA-rABE 靶向 CTNNB1，將第 41 位氨基酸由蘇氨酸（T）轉(zhuǎn)換成丙氨酸（A），使其編碼的蛋白 β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)中免被降解，進(jìn)入細(xì)胞核后激活 TCF/LEF-Fluc 表達(dá)。研究結(jié)果表明，光照組小鼠的熒光素酶信號(hào)顯著增強(qiáng)，熒光素酶活性是黑暗組的 186 倍，證明 PA-rABE 能在體內(nèi)精準(zhǔn)地編輯功能性?xún)?nèi)源 RNA。此外，研究團(tuán)隊(duì)還將 PA-rABE 系統(tǒng)用于疾病治療，通過(guò) AAV 遞送系統(tǒng)，PA-rABE 成功地在光照條件下通讀 F9 基因，修復(fù)了 B 型血友病小鼠的凝血功能，展示了其在精準(zhǔn)基因治療中的應(yīng)用潛力，為精準(zhǔn)調(diào)控治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)提供了概念驗(yàn)證。

華東師范大學(xué)副研究員李慧瑩、博士研究生邱昱皓、碩士研究生宋博聞、權(quán)心怡為論文共同第一作者；華東師范大學(xué)為第一單位；華東師范大學(xué)李大力研究員、劉明耀教授和杜冰教授為共同通訊作者。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41587-025-02610-2