2012 年，CRISPR-Cas9的發(fā)現(xiàn)開啟了基因編輯新時代，此后的十多年里，基于CRISPR的基因編輯技術得到了快速發(fā)展，并被成功應用放到了人體臨床試驗中已治療遺傳疾病和癌癥。與此同時，全世界的科學家們也在不斷挖掘新的具有基因編輯潛力的新工具，以解決Cas9 蛋白體積過大（約1400個氨基酸），難以通過 AAV 病毒載體進行遞送以進行體內基因編輯的難題。
該研究通過對 CRISPR-Cas9 的祖先IscB進行進化改造，成功創(chuàng)造出僅有 Cas9 一半大小的NovalscB系統(tǒng)（僅 614 個氨基酸），基因編輯效率提升百倍，研究團隊將NovalscB系統(tǒng)與甲基轉移酶融合，進而創(chuàng)建一個可編程的表觀遺傳編輯系統(tǒng)——OMEGAoff，其緊湊程度足以被裝載到單個腺相關病毒（AAV）載體中，通過單次 AAV 注射即可實現(xiàn)長達 6 個月的持久基因表達抑制。
2025 年 5 月 7 日，張鋒團隊在Nature Biotechnology期刊發(fā)表了題為：Evolution-guided protein design of IscB for persistent epigenome editing in vivo的研究論文。
該研究通過整合直系同源物篩選、進化和結構引導相結合的蛋白質工程方法、RNA 工程以及基于深度學習的結構預測，對 IscB 蛋白及其向導 RNA（ωRNA）進行工程化改造，從而生成了NovaIscB。
這一緊湊型基因編輯工具NovaIscB在人類基因組上實現(xiàn)了高達 40% 的插入/缺失編輯活性（效率相比野生型 OgeuIscB 提升約 100 倍），并且相對于現(xiàn)有的 IscB 具有更高的特異性。該研究進一步證明，NovaIscB 可與甲基轉移酶融合，從而創(chuàng)建一個可編程的表觀遺傳編輯系統(tǒng)——OMEGAoff，其緊湊程度足以被裝載到單個腺相關病毒（AAV）載體中，可在體內實現(xiàn)持久的基因抑制（持久抑制PCSK9 基因表達，顯著降低膽固醇水平，效果持續(xù)超過 6 個月）。
更重要的是，該研究提出的結合進化和結構引導的蛋白質工程方法，為優(yōu)化蛋白質功能提供了一個新框架，其潛在應用遠遠超出了基因組編輯的范疇。
Cas9 的祖先：IscB 的先天優(yōu)勢與短板
在基因編輯領域，如何將基因編輯器精準且高效地遞送到體內特定的組織/器官，始終是一項重大挑戰(zhàn)。
2021年9月，張鋒團隊在Science期刊發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)了一類廣泛的轉座子編碼的 RNA 引導核酸酶，并將其命名為OMEGA 系統(tǒng)（包括IscB、IsrB、Tnp8），它們同樣使用一段RNA（ωRNA）來指導切割 DNA 雙鏈。
其中，IscB被認為是 Cas9 的祖先，更重要的是，IscB 非常小，大約 300-550 個氨基酸，僅為Cas9 的約 30%，這意味著它們可被開發(fā)為新的小型化基因編輯工具，從而更容易被遞送到細胞內。
但原始的 IscB 存在三大硬傷：
1、有效向導RNA 長度僅 13bp，導致特異性較低，易脫靶，與之相比，Cas9 的有效向導RNA 長度為 17-20bp；
2、編輯效率不足野生型 Cas9 的 1%；
3、無法適配復雜的表觀遺傳編輯工具。
進化指導的智能改造：四步打造基因魔剪
張鋒團隊采用“自然篩選+人工智能”的創(chuàng)新策略，通過四個關鍵步驟重塑 IscB：
1、自然寶庫篩選
從 144 種 IscB 天然變體中，發(fā)現(xiàn)源自人類腸道微生物的 OrufIscB，其編輯效率比前代提升 5-10 倍。
2、結構嫁接
將 Cas9 的 REC 結構域（負責識別和結合目標 DNA 序列）精準移植到 IscB，將有效 引導RNA 長度延長至 20bp，脫靶率降低 3 倍。
3、定向進化
通過深度突變掃描，篩選出關鍵位點E137K/E409R/I533K，使編輯活性再提升 2 倍。
4、RNA工程
精簡向導RNA 結構，將其從 225nt 縮短至 166nt，使人類細胞中的向導RNA（ωRNA）表達量提升4 倍，適配化學合成遞送。
通過這四個步驟，張鋒團隊創(chuàng)造了NovalscB系統(tǒng)：
• 編輯效率達 40%，媲美傳統(tǒng) Cas9；
• 特異性與 SpCas9 相當，遠超同類小型化基因編輯工具；
• 整個系統(tǒng)尺寸（IscB蛋白 + gRNA）僅 614aa + 166nt，輕松裝入單個 AAV 病毒。
更重要的是，NovalscB系統(tǒng)還可進一步用于構建堿基編輯器和表觀遺傳編輯器。
體內持久編輯：改寫表觀基因編輯的新可能
張鋒團隊進一步將切割活性喪失的 NovalscB 與甲基轉移酶融合，構建了表觀遺傳編輯器——OMEGAoff系統(tǒng)。
研究團隊使用單個 AAV 載體包裝OMEGAoff 系統(tǒng)，通過靜脈注射遞送，靶向編輯 PCSK9 基因，結果顯示，從注射后 3 周開始，小鼠血清中 PCSK9 蛋白水平顯著降低，從注射后 4 周開始，小鼠血清中膽固醇水平顯著顯著下降，降低幅度與使用 PCSK9 單抗的臨床效果相當，這些效果穩(wěn)定持續(xù)到實驗結束（6 個月）。為了評估OMEGAoff 系統(tǒng)的毒性，研究團隊在實驗結束時檢測了血清總膽紅素和丙氨酸氨基轉移酶水平，未觀察到顯著變化。這些結果突顯了使用 OMEGAoff 進行持久基因抑制和表觀基因組編輯的潛力。
總的來說，這項研究通過進化和結構引導的蛋白質設計，研究了1000 多種變體，從而創(chuàng)建了NovaIscB以及基于NovaIscB 的表觀遺傳編輯器——OMEGAoff系統(tǒng)，為基因編輯以及表觀遺傳編輯工具箱提供了有前景的新工具。該研究提出的結合進化和結構引導的蛋白質工程方法，為優(yōu)化蛋白質功能提供了一個新框架，其潛在應用遠遠超出了基因組編輯的范疇。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-025-02655-3
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