雙旁位抗體（bpAbs）結(jié)合抗原上不同的、不重疊的表位。這種獨(dú)特的結(jié)合模式實(shí)現(xiàn)了超越單特異性和雙特異性抗體（bsAbs）的新作用機(jī)制，使bpAbs成為各種適應(yīng)癥（包括腫瘤學(xué)和傳染?。┑挠行Н煼?。雙旁位結(jié)合可導(dǎo)致卓越的親和力和特異性，促進(jìn)拮抗作用，鎖定靶標(biāo)構(gòu)象，并導(dǎo)致更高階的靶標(biāo)聚集。這種抗體-靶標(biāo)復(fù)合物可以引起強(qiáng)烈的激動(dòng)，增加免疫效應(yīng)器功能，或?qū)е驴焖傧抡{(diào)靶標(biāo)和溶酶體運(yùn)輸。這些不僅是治療性抗體的有吸引力的特性，而且越來越多地被探索用于其他形式，例如抗體-藥物偶聯(lián)物、T細(xì)胞接合器和嵌合抗原受體。bpAb工程的最新進(jìn)展使構(gòu)建更復(fù)雜的構(gòu)型成為可能，這些構(gòu)型開始在臨床上顯示出前景。

       【NO.1】介紹

       2022年，抗體療法占美國新藥批準(zhǔn)的30%。在正在開發(fā)的抗體中，已經(jīng)觀察到包括雙特異性抗體（bsAbs）在內(nèi)的高度工程化分子的數(shù)量顯著增加。雙旁生抗體（bpAbs）是bsAb的一個(gè)子集，對(duì)同一分子靶標(biāo)上的獨(dú)特、不重疊的表位具有特異性。這種獨(dú)特的結(jié)合模式成立于30多年前，可實(shí)現(xiàn)差異化的作用機(jī)制（MoA）。在過去的十年中，隨著臨床試驗(yàn)的首次成功，bpAbs的治療潛力變得明顯。這些開創(chuàng)性的分子為當(dāng)今臨床開發(fā)中越來越多的bpAb鋪平了道路（表1)。本文概述了bpAb的多種形式和MoA、當(dāng)前的臨床流程和前景。

       表1.臨床中的雙旁位抗體。分子按第一次臨床試驗(yàn)開始的時(shí)間順序列出

       【NO.2】雙抗體決定簇構(gòu)型

       抗體發(fā)現(xiàn)和工程技術(shù)的進(jìn)步使越來越復(fù)雜的bpAb形式成為可能，這些形式可以針對(duì)不同結(jié)構(gòu)中的不同表位組裝結(jié)合結(jié)構(gòu)域。形式的選擇取決于靶生物學(xué)和建議的MoA。關(guān)鍵的設(shè)計(jì)考慮因素包括靶向表位、單個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和性質(zhì)、增加的半衰期延長(zhǎng)和效應(yīng)子功能介導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，以及確保將所有結(jié)構(gòu)域正確組裝成功能性bpAb的策略。后者可以像在單個(gè)蛋白質(zhì)中用靈活的接頭連接單個(gè)結(jié)構(gòu)域一樣簡(jiǎn)單，或者在含有bpAb的可結(jié)晶片段（Fc）結(jié)構(gòu)域中，取決于最多四種不同蛋白質(zhì)的正確配對(duì)，分別在重鏈（HC）和輕鏈（LC）中具有相應(yīng)的轉(zhuǎn)向突變。生產(chǎn)性表位對(duì)很難合理預(yù)測(cè)或使用抗體混合物預(yù)測(cè)。因此，以給定bpAb構(gòu)型高效生成和篩選表位對(duì)的大基質(zhì)的能力是關(guān)鍵。除了功能和可行性之外，在選擇bpAb形式時(shí)，可開發(fā)性考慮因素也至關(guān)重要。及早檢測(cè)BPAb的生物物理責(zé)任可以降低動(dòng)物研究和臨床試驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。同樣，由于bpAb構(gòu)型復(fù)雜性可能導(dǎo)致可開發(fā)性差或副產(chǎn)品錯(cuò)配，因此bpAb形式的選擇會(huì)影響下游生產(chǎn)和質(zhì)量控制。

       迄今為止在臨床上測(cè)試的bpAb不僅具有多種形式，而且還利用了大量不同的單個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖1)。單鏈抗體形式，尤其是單結(jié)構(gòu)域抗體（sdAbs）和單鏈可變片段（scFvs），很容易以雙旁生形式配對(duì)。因此，首批進(jìn)入臨床的兩個(gè)bpAbALX-0651和BI1034020，由串聯(lián)sdAb組成?；诳贵w片段的bpAb在循環(huán)中通常半衰期較短，需要進(jìn)一步工程改造以改善暴露。小尺寸使sdAb成為嵌合抗原受體（CAR）的理想組成部分，正如雙旁位CAR-T療法cilta-cel所強(qiáng)調(diào)的那樣和OriCAR-017。

       圖1.在臨床試驗(yàn)中評(píng)估的bpAb架構(gòu)。REGN5093-M114每個(gè)抗體平均包含3.2種非特異性偶聯(lián)藥物。MBS301不含六聚化增強(qiáng)突變；*藥物抗體比和偶聯(lián)位點(diǎn)與所示示例不同。

       迄今為止，在臨床上測(cè)試的大多數(shù)bpAb都具有更典型的含F(xiàn)c的結(jié)構(gòu)，可以通過HC軸的對(duì)稱性（圖1)。對(duì)稱bpAb由相同的HC或HC/LC對(duì)組成，而不對(duì)稱分子由具有不同結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不同半部分組成。四價(jià)分子MEDI4276和BAT2022是具有2+2化合價(jià)（每個(gè)整數(shù)描述分子中存在的相同旁位的數(shù)量）和scFvs或sdAb的示例，分別附加到HC的N端或C端。另一方面，KN060是一種對(duì)稱的bpAb，具有串聯(lián)的sdAb臂，沒有LC。與KN060類似，三特異性TAVO412通過嵌入更復(fù)雜的不對(duì)稱構(gòu)型的串聯(lián)sdAb臂實(shí)現(xiàn)雙旁位靶向。不對(duì)稱bpAb通常依賴于Fc突變來促進(jìn)bpAb產(chǎn)物的純化或指導(dǎo)異二聚體的形成。例如，REGN5093的兩種HC經(jīng)過工程改造，對(duì)蛋白A表現(xiàn)出不同的親和力，并允許純化異二聚體產(chǎn)物。另一方面，GEN3009是一種不對(duì)稱的bpAb，具有Fc結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)向突變，可確保兩種不同HC的正確配對(duì)。除了HC異二聚化之外，正確的LC配對(duì)對(duì)于不對(duì)稱bpAb來說可能是一個(gè)挑戰(zhàn)。在GEN3009示例中，通過兩個(gè)母體抗體的溫和體外反應(yīng)實(shí)現(xiàn)正確配對(duì)，該反應(yīng)允許HC重組，而不會(huì)擾亂原始LC配對(duì)。REGN5093說明了一種完全避免LC配對(duì)問題的替代策略，它由兩個(gè)不同的HC與兩個(gè)相同的LC配對(duì)組成。這種常見的液相色譜可以直接從具有明確液相色譜多樣性的發(fā)現(xiàn)平臺(tái)（如REGN5093例）獲得，也可以從現(xiàn)有液相色譜（如anbenitamab和GR2002）衍生而來。ISB1442和SAR441236是不對(duì)稱bpAb的例子，它們分別通過額外的Fab或scFv結(jié)構(gòu)域擴(kuò)展免疫球蛋白G（IgG）結(jié)構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)更高的化合價(jià)，甚至在SAR441236的情況下實(shí)現(xiàn)三旁位結(jié)合。較小的非對(duì)稱構(gòu)型，例如基于fragment-Fab的zanidatamab或基于片段的TNB-738也可以被利用。Zanidatamab將scFv結(jié)構(gòu)域與完整的Fab臂配對(duì)，而TNB-738的結(jié)合臂來自兩個(gè)sAb，并添加了惰性LC以實(shí)現(xiàn)可制造性。除了免疫球蛋白折疊之外，一種雙旁位設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白（DARPin）MP0274突出了替代支架的潛力。Labrijnetal..全面介紹了所有雙特異性形式。

       【NO.3】bpAbs的MoAs

       3.1雙旁位靶向可通過親和力增強(qiáng)結(jié)合

       與其他抗體相比，與同一靶標(biāo)上的兩個(gè)不同、不重疊的表位結(jié)合導(dǎo)致bpAb具有獨(dú)特的特性。與單旁原母抗體相比，許多bpAb表現(xiàn)出更好的結(jié)合和更慢的與靶標(biāo)的解離。這是在相同（順式）或不同（反式）靶分子（圖2a)。親和力定義為單個(gè)分子的多個(gè)非共價(jià)相互作用的組合，以及一旦建立第一次相互作用，結(jié)合和再結(jié)合事件的可能性就會(huì)增加。靶向不同表位的抗體片段可以通過親和力進(jìn)行連接，以增加靶標(biāo)親和力，正如基于sdAb的、經(jīng)過臨床評(píng)估的bpAbsALX-0651和BI1034020所強(qiáng)調(diào)的那樣。與單價(jià)或二價(jià)單克隆抗體（mAb）相比，bpAb的解離速度可能非常慢，使其成為更優(yōu)的拮抗劑或反向激動(dòng)劑。順式結(jié)合形成1：1 bpAb靶標(biāo)復(fù)合物對(duì)于此類應(yīng)用以避免不需要的激動(dòng)劑活性非常重要。除了表位選擇之外，結(jié)合結(jié)構(gòu)域的幾何排列、sdAb接頭優(yōu)化和親和力調(diào)整對(duì)于實(shí)現(xiàn)所需的MoA和最大化療效也至關(guān)重要。Kast及其同事證明，結(jié)合域的幾何形狀對(duì)于雙旁位和四價(jià)融合蛋白的人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）拮抗作用至關(guān)重要，某些構(gòu)型顯示出激動(dòng)劑活性。同樣，三位抗表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）IgG-纖連蛋白融合的不同結(jié)構(gòu)在受體下調(diào)方面顯示出不同的療效。對(duì)于基于sCDab的拮抗劑，最佳方向和接頭特性可以通過順式中的avid結(jié)合實(shí)現(xiàn)超高親和力。最后，臨床bpAb ISB1442依賴于仔細(xì)調(diào)整CD38和CD47親和力，以降低靶向毒性。ISB1442的抗CD47Fab經(jīng)過工程改造，具有弱親和力，可與CD47陽性紅細(xì)胞實(shí)現(xiàn)最低反應(yīng)性。高親和力、雙旁位、抗CD38臂能夠?qū)D38低腫瘤細(xì)胞進(jìn)行狂熱的靶標(biāo)參與和高特異性。

       圖2.bpAbs的MoAs。（a）bAb在cis或trans中avid靶標(biāo)結(jié)合的示意圖。BpAbs可以解鎖新的生物活性，例如（b）雙途徑抑制，（c）將胞外結(jié)構(gòu)域鎖定在酶非活性狀態(tài)，或（d）雙旁位受體靶向形成更高階的復(fù)合物并引發(fā)激動(dòng)。（e）或者，反式bpAb結(jié)合的受體和Fc結(jié)構(gòu)域聚集可導(dǎo)致快速內(nèi)化和溶酶體運(yùn)輸或強(qiáng)效應(yīng)功能，特別是補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。

       bpAbs的高親和力和緩慢解離對(duì)于免疫細(xì)胞的募集也很有吸引力。例如，Liu及其同事通過將兩個(gè)靶向不重疊表位的sdAb與抗CD3Fab融合，設(shè)計(jì)了一種參與抗HER2bpAb的T細(xì)胞。所得構(gòu)建體顯示，與相應(yīng)的單旁位母體分子相比，與HER2陽性細(xì)胞的結(jié)合增加了30倍，并且在HER2低表達(dá)模型中體內(nèi)具有優(yōu)異的腫瘤抑制活性。同樣，Rennert等人設(shè)計(jì)了一種針對(duì)C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族12成員A（CLEC12A）的雙旁位橋接蛋白，該蛋白由抗CD19CAR-T細(xì)胞分泌并募集。雙旁原靶向?qū)崿F(xiàn)的高親和力導(dǎo)致抗CD19CAR-T細(xì)胞毒性增加。由于sdAb體積小，CAR可以直接配備bpAbs，正如cilta-cel所強(qiáng)調(diào)的那樣和OriCAR-017。這種CAR的高親和力雙旁位結(jié)合可以導(dǎo)致增強(qiáng)和持續(xù)的療效。如上所述，對(duì)于基于sCDab的拮抗劑，仔細(xì)選擇表位和接頭優(yōu)化可能是關(guān)鍵。

       3.2 bpAbs可實(shí)現(xiàn)雙途徑抑制，并可以鎖定受體和外胚酶的構(gòu)象

       與兩個(gè)不重疊的表位結(jié)合可以解鎖bpAb的獨(dú)特活性。例如，雙途徑抑制是通過靶向bpAb的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（LRP6）實(shí)現(xiàn)的，以同時(shí)阻斷Wnt1和Wnt3a介導(dǎo)的β-catenin信號(hào)通路，特別是沒有激動(dòng)劑活性。圖（2b)，或者，bpAb可以通過物理限制來滅活其靶標(biāo)。靶向亞結(jié)構(gòu)域I和IV的雙旁位抗HER2 DARPin的晶體結(jié)構(gòu)揭示了兩種HER2受體的結(jié)合和扭曲，從而阻止了與EGFR家族成員形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力二聚體。此外，針對(duì)CD38和CD73的bpAb，包括臨床bpAbTNB-738，通過將各自的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域鎖定在催化失活狀態(tài)（圖2c)。雖然單個(gè)母體抗體沒有顯示出任何活性，但抗CD73bpAb具有亞納摩爾活性并達(dá)到90%>抑制。

       3.3雙抗原可形成免疫復(fù)合物，導(dǎo)致激動(dòng)、快速靶標(biāo)內(nèi)化、溶酶體運(yùn)輸和免疫效應(yīng)器功能改善

       bpAb的一個(gè)獨(dú)特特征是它們能夠通過在反式中同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不重疊的表位來形成高階免疫復(fù)合物。靶標(biāo)交聯(lián)是多種MoA的基礎(chǔ)，包括增強(qiáng)的激動(dòng)作用、Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能或可溶性靶標(biāo)的清除以及受體下調(diào)。

       bpAb的聚集可以促進(jìn)激動(dòng)性，特別是對(duì)于依賴交聯(lián)進(jìn)行有效下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體（圖2d)。例如，腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）的成員因其在免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖中的作用而成為重要的治療靶標(biāo)。TNFRSF靶向mAb通常依賴于Fc受體介導(dǎo)的高階聚集，這阻礙了其治療應(yīng)用。Yang及其同事最近表明，針對(duì)TNFRSF成員OX40和死亡受體5（DR5）的四價(jià)bpAb實(shí)現(xiàn)了優(yōu)于外源交聯(lián)母mAb的強(qiáng)大內(nèi)源激動(dòng)作用，突出了bpAb激動(dòng)劑的潛力。BpAb也可能具有激活多組分受體復(fù)合物的獨(dú)特位置。例如，Shi等人設(shè)計(jì)了一種靶向β-klotho的兩個(gè)不同表位的bpAb，-klotho是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)受體1c（FGFR1c）的共受體。雙旁位靶向?qū)τ谝l(fā)有效的激動(dòng)既必要又充分。

       bpAbs的受體聚集增加了Fc結(jié)構(gòu)域的局部濃度，從而導(dǎo)致效應(yīng)器功能的改善（圖2e)。已在mAb靶向的多價(jià)復(fù)合物中觀察到這種效應(yīng)，例如治療性mAb利妥昔單抗靶向的B細(xì)胞標(biāo)志物CD20?？贵w的雙旁原結(jié)合可以將這種MoA擴(kuò)展到更多靶標(biāo)。例如，由于Fc結(jié)構(gòu)域預(yù)組織和導(dǎo)致的C1q沉積增加，與母體mAb的組合相比，zanidatamab形成大的HER2簇被證明會(huì)導(dǎo)致更有效的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）。通過在Fc結(jié)構(gòu)域中引入六聚化增強(qiáng)點(diǎn)突變，這種作用在抗CD37bpAbGEN3009中進(jìn)一步放大。雖然不太明顯，但bpAbs的Fc聚集已被證明通過增加與自然殺傷（NK）細(xì)胞上FcγRIII受體的結(jié)合，進(jìn)一步改善抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）。類似地，抗白細(xì)胞介素6（IL6）bpAb形成簇用于增加Fcγ受體與吞噬細(xì)胞的結(jié)合并促進(jìn)可溶性靶標(biāo)的快速清除。

       交聯(lián)受體筏已被證明可快速內(nèi)化并轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，導(dǎo)致靶標(biāo)快速下調(diào)。圖（2e)。值得注意的是，交聯(lián)效率和相關(guān)效應(yīng)可能取決于表位選擇以及bpAb：靶標(biāo)幾何形狀?？焖賰?nèi)化和溶酶體運(yùn)輸使bpAb越來越成為抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）的構(gòu)建單元，它們驅(qū)動(dòng)腫瘤遞送和細(xì)胞毒性有效載荷的細(xì)胞內(nèi)釋放，如MEDI4276、REGN5093-M114和zanidatamab zovodotin（由Zymeworks Inc研發(fā)的一種生物藥，是一種HER2拮抗劑）所示。與單旁位素藥物相比，雙旁生抗葉酸受體α（FRα）ADCIMGN151表現(xiàn)出優(yōu)異的有效載荷遞送。由于這種效應(yīng)與細(xì)胞表面的FRα密度無關(guān)，因此推測(cè)IMGN151有效載荷遞送的增加是促進(jìn)FRα陽性細(xì)胞上結(jié)合事件的結(jié)果，而不是聚集，聚集應(yīng)該隨著受體密度的增加而減少。然而，這兩個(gè)MoA并不相互排斥，需要進(jìn)一步研究來闡明IMGN151的MoA。

       3.4不同表位同時(shí)結(jié)合可以克服耐藥機(jī)制

       治療病毒感染的一個(gè)常見挑戰(zhàn)是找到一種廣泛中和抗體（bnAb），該抗體可結(jié)合外殼蛋白的保守區(qū)域并產(chǎn)生持久的反應(yīng)。單特異性抗體可以靶向保守區(qū)域，但由于它們對(duì)病毒施加選擇性壓力，因此容易受到突變逃逸的影響。原則上與使用小分子藥物的混合物類似，bnAb的組合已被證明可通過減少單藥突變逃逸變異的機(jī)會(huì)來降低單藥治療耐藥性。雙旁位bnAb結(jié)合了混合物的臨床益處和單藥給藥的易用性，使其成為一個(gè)令人興奮的開發(fā)領(lǐng)域。BAT2022，靶向嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的雙旁原bnAb被證明可與所有主要關(guān)注的變體結(jié)合，包括不再被親本抗體之一識(shí)別的受體結(jié)合域（RBD）突變體。對(duì)于HIV，三旁位bnAb SAR441236和幾種臨床前分子通過靶向病毒外殼蛋白上的多個(gè)表位顯示出前景。

       防止耐藥性的多旁位靶向在臨床上也可用于腫瘤相關(guān)抗原（TAA）靶向。腫瘤細(xì)胞可以消除靶向表位，例如通過選擇性剪接。據(jù)推測(cè)，雙旁位CAR-T細(xì)胞可以通過同時(shí)靶向兩個(gè)表位來防止腫瘤逃逸。雖然進(jìn)一步的機(jī)制研究很重要，但這是癌癥免疫治療的一個(gè)有趣前景。盡管概念不同，但Spangler及其同事證明，三旁EGFR靶向可以恢復(fù)對(duì)下游信號(hào)通路突變的西妥昔單抗耐藥異種移植模型的療效。最有效的三旁原位構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)了單獨(dú)使用雙旁位或單旁位構(gòu)建體無法實(shí)現(xiàn)的必要受體下調(diào)水平。

       【NO.4】治療應(yīng)用和方式

       迄今為止，大多數(shù)bpAb已被開發(fā)用于腫瘤學(xué)應(yīng)用，并且cilta-cel是首個(gè)基于bpAb的細(xì)胞療法已獲批用于復(fù)發(fā)和難治性多發(fā)性骨髓瘤。許多其他BPAb目前正處于血液系統(tǒng)癌癥的早期臨床試驗(yàn)中，包括ISB1442和OriCAR-017，它們都處于I期，用于治療復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤。

       對(duì)于實(shí)體瘤的治療，許多bpAb靶向HER2，它是一種受體酪氨酸激酶，參與包括細(xì)胞增殖在內(nèi)的各種細(xì)胞功能。在20-25%的乳腺癌患者中觀察到高水平的HER2過表達(dá)。用分別與非重疊結(jié)構(gòu)域IV和II結(jié)合的臨床mAb曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合靶向兩個(gè)不同的HER2表位，先前已被證明可顯著改善治療結(jié)果和預(yù)后。HER2的重要性和雙表位靶向的臨床先例可能解釋了正在研發(fā)的大量抗HER2雙抗體，包括anbenitamab和zanidatamab，這是兩種臨床上最先進(jìn)的HER2靶向bpAbs。bpAb也追求其他重要的腫瘤靶點(diǎn)，包括間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（MET）和FRα分別通過REGN5093（?M114）和IMGN151。

       除腫瘤學(xué)外，臨床候選藥物SAR441236和BAT2022突出了BPAb在傳染病中的潛力。抑制bnAb在急性感染中廣泛實(shí)施的一個(gè)挑戰(zhàn)是逃逸變體的出現(xiàn)，正如最近的SARS-CoV-2大流行所說明的那樣。靶向單個(gè)表位的mAb僅在突變逃逸變異發(fā)展并廣泛傳播之前有效，從而使現(xiàn)有療法無效。針對(duì)多個(gè)表位的BnAb，例如SARS-CoV-2靶向bpAbBAT2022或HIV靶向三旁抗體SAR441236，可以克服急性和慢性疾病中出現(xiàn)的單突變逃逸變異，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)使用和更持久的患者反應(yīng)。

       大多數(shù)臨床bpAb作為裸抗體發(fā)揮作用，以治療病毒感染，通過相應(yīng)的受體抑制或促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，或者如TNB-738的情況，通過抑制酶活性。作為ADC的一部分，bpAb越來越多地用于有效載荷輸送如上所述，由于它們獨(dú)特的MoA可促進(jìn)內(nèi)化和溶酶體運(yùn)輸。目前有6種雙旁生ADC正在臨床評(píng)估中，其中3種也作為裸bpAb進(jìn)行研究。此外，bpAb的高親和力和選擇性對(duì)于高效的T細(xì)胞募集劑和CAR的工程設(shè)計(jì)具有吸引力。

       在本文中，我們討論了已經(jīng)或正在臨床上針對(duì)可獲得數(shù)據(jù)的分子測(cè)試的bpAb的結(jié)構(gòu)、MoA和活性。

       ALX-0651

       Ablynx的ALX-0651是一種雙旁位CXCR4靶向串聯(lián)sdAb，是第一個(gè)臨床上使用的抗GPCR的生物制劑，據(jù)我們所知，它是第一個(gè)進(jìn)入臨床的bpAb（2011年）。雖然ALX-0651的單個(gè)sdAb構(gòu)建單元顯示出中性拮抗劑活性，但雙旁位ALX-0651不僅表現(xiàn)出更高的親和力，而且顯示出對(duì)CXCR4的反向激動(dòng)劑活性。由于缺乏優(yōu)于護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，ALX-0651已停產(chǎn)。

       BI1034020

       BI1034020是由Ablynx和BoehringerIngelheim開發(fā)的雙旁生、半衰期延長(zhǎng)的串聯(lián)sdAb。該bpAb靶向大腦中β淀粉樣蛋白（Aβ）的兩個(gè)獨(dú)立表位，旨在用于治療阿爾茨海默病。BI1034020的I期研究始于2013年，但在發(fā)生與藥物相關(guān)的嚴(yán)重不良事件后停止。

       MEDI4276

       MEDI4276是由Medimmune開發(fā)的抗HER2ADC，于2015年進(jìn)入臨床。MEDI4276由基于曲妥珠單抗scFv靶向結(jié)構(gòu)域IV的四價(jià)bpAb組成，該結(jié)構(gòu)域在N端與mAb39S靶向結(jié)構(gòu)域II的重鏈融合。該bpAb將四個(gè)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的微管溶血素有效載荷遞送給HER2過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，其中ADC被內(nèi)化并轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體以釋放細(xì)胞毒性有效載荷。與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合相比，MEDI4276可以通過將HER2運(yùn)輸從回收重定向到溶酶體降解來交聯(lián)受體，從而實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)化和高效的細(xì)胞質(zhì)遞送。在I期劑量遞增研究中，MEDI4276在HER2陽性乳腺癌和胃癌中顯示出臨床活性，但最終由于不良毒性特征而停止。

       Ciltacabtagene autoleucel

       據(jù)我們所知，Ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）是迄今為止第一個(gè)也是唯一一個(gè)獲批的基于bpAb的療法。cilta-cel最初由傳奇生物開發(fā)，名稱為L(zhǎng)CAR-B38M，是第二代自體CAR-T療法，具有雙旁位胞外結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)靶向B細(xì)胞成熟抗原（BCMA）上不同表位的sdAb。Cilta-cel于2022年獲得批準(zhǔn)，基于CARTITUDE-1Ib/II期研究（NCT03548207），該研究顯示其反應(yīng)深刻而持久，安全性可控。97.9%的總體緩解率甚至高于初始I期研究（NCT03090659）中觀察到的87.8%。

       Zanidatamab和zanidatamab zovodotin

       bpAb zanidatamab（ZW25）源自Zymeworks專有的AzymetricFc平臺(tái)，將靶向IV的HER2結(jié)構(gòu)域scFv與識(shí)別結(jié)構(gòu)域II的Fab臂相結(jié)合。Zanidatamab以反式方式結(jié)合兩個(gè)HER2分子，在細(xì)胞膜上誘導(dǎo)不同的受體重組。除了快速內(nèi)化和下調(diào)外，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的聚集還會(huì)引發(fā)強(qiáng)CDC，這在曲妥珠單抗、帕妥珠單抗或它們的組合中均未觀察到。與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合相比，雙旁位HER2參與在體內(nèi)異種移植模型中導(dǎo)致卓越的抗腫瘤活性。Zanidatamab被證明對(duì)患有一系列具有不同HER2表達(dá)水平的腫瘤的患者是安全的。Zanidatamab目前正在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行研究，包括乳腺癌（NCT04224272）的II期試驗(yàn)和晚期胃食管腺癌（NCT05152147）的III期試驗(yàn)。Zanidatamab也正在探索用于遞送細(xì)胞毒性微管蛋白抑制劑。這種雙旁位ADCzanidatamabzovodotin（ZW49）已被證明是免疫原性細(xì)胞死亡標(biāo)志的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，并且對(duì)具有一系列HER2表達(dá)的乳腺癌和胃癌患者來源的異種移植模型具有高度活性。I期臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中（NCT03821233）。

       MP0274系列

       MP0274由Molecular Partners開發(fā)，通過DARPins實(shí)現(xiàn)雙旁位HER2靶向，DARPins是可以像串珠一樣連接的替代支架。四價(jià)MP0274分子分別包含一個(gè)針對(duì)HER2靶結(jié)構(gòu)域I和IV的DARPin，以及兩個(gè)用于延長(zhǎng)半衰期的人血清白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。與基于IgG的抗HER2bpAb一樣，MP0274與HER2受體交聯(lián)，導(dǎo)致在各種HER2陽性細(xì)胞系和小鼠模型中具有與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗聯(lián)合治療相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性。然而，MP0274可能通過穩(wěn)定AKT調(diào)節(jié)的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOX03a導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)出獨(dú)特的MoA。在HER2陽性實(shí)體瘤患者的I期研究中，MP0274顯示出良好的暴露和良好的安全性。然而，出于戰(zhàn)略原因，MP0274的進(jìn)一步臨床開發(fā)已停止。

       Anbenitamab和JSKN003

       康寧杰瑞腫瘤科設(shè)計(jì)了一種基于曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的雙旁位HER2靶向抗體anbenitamab（KN026）。相應(yīng)HC的異二聚體Fc配對(duì)是通過將旋鈕插入孔和靜電轉(zhuǎn)向突變相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。基于HER2相互作用殘基的結(jié)構(gòu)解析，設(shè)計(jì)了一種可以分別與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗HC高效配對(duì)的通用液相色譜。與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗聯(lián)合治療相比，所得的bpAb anbenitamab在具有不同HER2水平和小鼠模型中活性相當(dāng)?shù)膸追N腫瘤細(xì)胞系中顯示出優(yōu)異的抗腫瘤活性。初步表征表明，anbenitamab保留了在母體mAb中觀察到的ADCC和抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用（ADCP），同時(shí)與HER2的兩個(gè)不同表位結(jié)合。Anbenitamab于2018年進(jìn)入臨床，并在晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中顯示出良好的安全性，這些患者至少在包括曲妥珠單抗在內(nèi)的一種先前治療中取得了進(jìn)展。Anbenitamab在第二項(xiàng)臨床試驗(yàn)中耐受性良好，包括表達(dá)HER2的晚期胃癌和胃食管結(jié)合部癌患者?；诹己玫某跏蓟钚?，anbenitamab目前正在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估，包括兩項(xiàng)注冊(cè)研究，作為HER2陽性晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌（NCT05427383）的二線治療和HER2陽性復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性乳腺癌（NCT05838066）的一線治療，兩者均與化療聯(lián)合使用。anbenitamab與拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的偶聯(lián)提供了雙旁位抗HER2ADCJSKN003，目前正在晚期實(shí)體瘤（NCT05494918）的首次人體I期研究中進(jìn)行評(píng)估。

       其他靶向HER2的bpAb

       MBS301、BCD-147、TQB2930和KM257是基于曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的另外四種臨床階段抗HER2雙抗體。MBS301結(jié)合了曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的果糖基化半抗體，它們?cè)诠こ袒腃HO細(xì)胞系中單獨(dú)產(chǎn)生，并使用旋鈕入孔突變?cè)隗w外異二聚化。從Fc結(jié)構(gòu)域中去除巖藻糖可增強(qiáng)ADCC活性，這與雙旁位靶向相結(jié)合，可在具有不同HER2水平的腫瘤細(xì)胞系以及小鼠模型中產(chǎn)生強(qiáng)大的活性。目前正在進(jìn)行一項(xiàng)I期臨床研究（NCT03842085），評(píng)估MBS301治療HER2陽性復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性惡性實(shí)體瘤的效果。

       Biocad的BCD-147采用不對(duì)稱scFv-Fab構(gòu)型，并已在健康志愿者（NCT03912441）的I期研究中進(jìn)行了測(cè)試。TQB2930由正大天慶藥業(yè)開發(fā)，正在研究用于HER2陽性實(shí)體瘤，作為HER2陽性乳腺癌和胃癌（NCT06115902）的裸抗體（NCT05380882）和ADC（TQB2102）。最后，玄珠生物正在開發(fā)不對(duì)稱通用液相色譜雙抗KM257，目前正在臨床研究中，用于HER2陽性實(shí)體瘤（NCT05320874）和用作HER2陽性晚期實(shí)體瘤（NCT05804864）的ADC（KM501）。

       SAR441236

       由于病毒遺傳多樣性高，識(shí)別和開發(fā)有效的HIVbnAb一直具有挑戰(zhàn)性。大分子和小分子單藥療法在很大程度上失敗了，因?yàn)檫x擇壓力增加了突變逃逸變異的機(jī)會(huì)。使用bnAb組合的臨床前和臨床研究顯示療效增強(qiáng)，證明了靶向多個(gè)表位的實(shí)用性。SAR441236由Sanofi（NCT03705169）處于I期臨床開發(fā)階段，由雙特異叉雙變量Ig樣（CODV-Ig）臂與具有第三個(gè)獨(dú)特特異性的Fab臂配對(duì)組成，使其成為三旁位bnAb。臨床前體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（NHP）猿猴-人類免疫缺陷病毒（SHIV）病毒攻擊模型中，三旁位bnAb在降低病毒載量和預(yù)防感染方面更有效。

       GEN3009

       Genmab將其專有的DuoBody和HexaBody技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)了GEN3009，這是一種靶向bpAb的CD37，具有增強(qiáng)的Fc介導(dǎo)的六聚化。該bpAb包含互補(bǔ)的Fc突變，可在體外受控的Fab-arm交換反應(yīng)中指導(dǎo)異二聚化，并通過E430G突變?cè)鰪?qiáng)六聚化。在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系以及患者來源的慢性淋巴細(xì)胞白血病樣本中，與單親本mAb或組合相比，由于雙表位靶向結(jié)合增強(qiáng)的六聚體化，導(dǎo)致Fc結(jié)構(gòu)域密度的局部增加，導(dǎo)致CDC優(yōu)于單親本mAb。Fc結(jié)構(gòu)域聚集進(jìn)一步增加了ADCC和ADCP，從而在幾種細(xì)胞系衍生的異種移植模型以及患者來源的非霍奇金淋巴瘤異種移植物中產(chǎn)生有效的抗腫瘤活性。GEN3009已在復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（NCT04358458）患者中進(jìn)行了首次人體試驗(yàn)，但出于戰(zhàn)略原因，最近停止了進(jìn)一步的臨床開發(fā)。

       REGN5093和REGN5093-M114

       再生元的雙旁位抗MET共LC抗體REGN5093已作為抗體（NCT04077099）和ADC（NCT04982224進(jìn)入臨床。REGN5093來源于Regeneron專有的VelocImmune平臺(tái)，可有效抑制不依賴配體的MET和HGF誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。再生元通過在REGN5093-M114中偶聯(lián)專有的細(xì)胞毒性美登素有效載荷，進(jìn)一步利用了REGN5093的這一特性。該分子在MET依賴性和MET非依賴性腫瘤模型中均顯示出療效，進(jìn)一步證明了雙旁位ADC方法的實(shí)用性。

       OriCAR-017

       Oricell的雙旁位GPRC5D靶向CAR-T細(xì)胞療法OriCAR-017已進(jìn)入臨床，用于治療復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤（NCT05016778）。與cilta-cel類似，OriCAR-017CAR包含靶向GPRC5D上兩個(gè)不同表位的串聯(lián)sdAb。作者推測(cè)，雙旁位靶向增加了其CAR-T細(xì)胞療法的特異性和親和力，從而提高了療效。報(bào)道了良好的I期安全性和有效性數(shù)據(jù)，并支持OriCAR-017的進(jìn)一步開發(fā)。

       SARS-CoV-2中和bpAb

       由SARS-CoV-2引起的全球大流行刺激了世界各地的大量研究工作，多個(gè)小組展示了使用sAb等抗體片段作為bpAb構(gòu)建單元的實(shí)用性。幾項(xiàng)研究表明，bpAbs需要多個(gè)同步突變，從而大大降低了突變逃逸的患病率。與通常通過抑制RBD-ACE2界面僅限于傳統(tǒng)阻斷MoA的單價(jià)結(jié)合相反，順式中的bpAb結(jié)合表現(xiàn)出阻斷和構(gòu)象變化，而反式中的雙旁位結(jié)合表現(xiàn)出阻斷和多聚化。臨床上最先進(jìn)的靶向bpAb的SARS-CoV-2BAT2022已完成I期安全性和耐受性研究（NCT05518695）。BAT2022是一種對(duì)稱的含2+2Fc的分子，由一個(gè)與HC的C端相連的sdAb分子組成。BAT2022保持了其作為bnAb對(duì)多種SARS-CoV-2亞變體的有效性，證明了作為治療性抗體的實(shí)用性。

       ISB 1442

       Ichnos Sciences的ISB1442是一種雙特異性bpAb，基于專有的BEAT2.0（基于TCR的抗體雙特異性結(jié)合）平臺(tái)。ISB1442在一個(gè)串聯(lián)Fab臂上以高親和力結(jié)合兩個(gè)不同的CD38表位，并將其與低親和力CD47 Fab臂結(jié)合，以阻斷吞噬細(xì)胞上的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）。低CD47親和力旨在防止對(duì)紅細(xì)胞的靶向毒性，同時(shí)在高親和力雙旁位CD38臂的熱烈引導(dǎo)下結(jié)合時(shí)啟用有效的抗腫瘤活性。ISB1442結(jié)合Fc突變?cè)鰪?qiáng)效應(yīng)器功能，不僅影響ADCP，還表現(xiàn)出ADCC和CDC。臨床前數(shù)據(jù)表明，與單一靶點(diǎn)藥物相比，這種復(fù)雜的MoA可能具有更高的療效和安全性。因此，ISB1442目前正在針對(duì)復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤（NCT05427812）患者的1/2期臨床研究中進(jìn)行評(píng)估。

       TNB-738型

       Ancora Biotech的TNB-738是一種不對(duì)稱的抗CD38bpAb，由源自Teneobio專有轉(zhuǎn)基因UniRat平臺(tái)的兩個(gè)sdAb組成，它們以高親和力與不同的CD38表位結(jié)合。TNB-738使用旋鈕插入孔突變來實(shí)現(xiàn)重鏈配對(duì)，完全沉默的IgG4Fc以消除效應(yīng)器功能，并在單臂上使用惰性kappaLC和CH1以提高可制造性。目前在健康志愿者（NCT05215912）中處于I期劑量遞增階段，TNB-738通過酶抑制發(fā)揮作用。

       IMGN151

       Immunogen的下一代FRαADC緊隨其第一代FRα ADC mirvetuximab-soravtansine之后進(jìn)入臨床（NCT05527184），該藥物于2022年獲得FDA的加速批準(zhǔn)。IMGN151包含一個(gè)scFv臂和一個(gè)mirvetuximab Fab臂配對(duì)，每個(gè)臂都結(jié)合FRα的獨(dú)特且不重疊的表位。IMGN151的雙旁位靶向模式可促進(jìn)FRα陽性細(xì)胞上的結(jié)合事件，從而在高、中和低表達(dá)FRα的細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)卓越的有效載荷遞送。與mirvetuximab soravtansine相比，bpAb的遞送增加與更有效的連接子有效載荷相結(jié)合，可能使IMGN151能夠解決更廣泛的患者群體。

       【NO.5】結(jié)論與展望

       bpAb由單特異性mAb的組合演變而來，已在2022年FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)基于bpAb的療法中證明了其臨床安全性和有效性。臨床管道中的bpAb基于多種形式，除了存在用于穩(wěn)定性和效應(yīng)器功能的Fc結(jié)構(gòu)域外，沒有明顯的趨勢(shì)。最終，生物學(xué)決定了bpAb的設(shè)計(jì)。與靶向不同表位的傳統(tǒng)mAb、bsAb甚至mAb組合相比，bpAb具有獨(dú)特的MoAs，使其成為適用于不同適應(yīng)癥的有吸引力的療法。雙旁原位結(jié)合所帶來的親和力可實(shí)現(xiàn)高度選擇性的腫瘤靶向，如bpAbISB1442，正如雙旁位CAR-T療法cilta-cel的臨床成功所強(qiáng)調(diào)的那樣，這些特性也可以使T細(xì)胞接合器或CAR-T細(xì)胞等治療方式受益。目前正在臨床上測(cè)試的大多數(shù)BPAb已被證明會(huì)影響TAA聚集，以改善受體激動(dòng)性、效應(yīng)子功能和/或有效的內(nèi)化和溶酶體運(yùn)輸。除了治療性mAb外，這種MoA特別適合改善細(xì)胞毒性有效載荷向腫瘤的遞送，目前正在臨床上評(píng)估的6種ADC就說明了這一點(diǎn)?；蛘?，雙旁位結(jié)合可以通過增加結(jié)合事件來改善有效載荷遞送，如IMGN151推測(cè)的那樣。除了狂熱的結(jié)合和受體聚集外，bpAb還用于其他MoA，例如雙途徑抑制、刺激多組分靶標(biāo)，或者以抗CD38bpAbTNB-738為例，將靶標(biāo)鎖定在酶促失活狀態(tài)。在傳染病中，bpAb有望解鎖bnAb，這些bnAb具有更高的反應(yīng)持久性，對(duì)多樣化的病毒景觀更有效，并且可以極大地限制突變逃逸變體的出現(xiàn)。該領(lǐng)域正在從雙旁生轉(zhuǎn)向三旁生，甚至更進(jìn)一步，以解決一些最 具挑戰(zhàn)性的人類疾病，例如HIV和SARS-CoV-2。

       正如臨床上BPAb數(shù)量的增加所證明的那樣，BPAb在靶向治療方面具有巨大的潛力。bpAbs的當(dāng)前臨床情況顯示，依賴于受體聚集的HER2靶向藥物和相關(guān)MoA濃度很高。HER2的突出性可以用曲妥珠單抗和帕妥珠單抗聯(lián)合治療的臨床先例來解釋。然而，隨著bpAb變得越來越容易獲得，新技術(shù)可以設(shè)計(jì)更復(fù)雜的架構(gòu)，我們預(yù)計(jì)bpAb靶標(biāo)和適應(yīng)癥的數(shù)量將大幅增加。由于其獨(dú)特的MoAs，以前在臨床上使用傳統(tǒng)抗體失敗的靶點(diǎn)可能會(huì)通過bpAb獲得，并且可能會(huì)出現(xiàn)特別適合bpAb的新靶點(diǎn)。正如SAR441236和臨床前研究所強(qiáng)調(diào)的那樣，三旁位或更高價(jià)結(jié)構(gòu)可以擴(kuò)展觀察到的bpAb效應(yīng)，甚至解鎖新的MoA。BPAb的臨床管道已得到BPAb療法的首次批準(zhǔn)驗(yàn)證，正在迅速擴(kuò)大，并將激勵(lì)對(duì)這一獨(dú)特抗體類別進(jìn)行更多研究，以充分利用BPAb在靶向治療中的潛力。