在分子生物學(xué)和生物技術(shù)的江湖里，大腸桿菌中重組蛋白的表達(dá)那可是一項(xiàng) "基本功"，就像武俠小說里大俠們必備的輕功一樣重要。那些能讓大腸桿菌中可溶性重組蛋白 "產(chǎn)量飆升" 的神奇添加物，這可是一場充滿驚喜與挑戰(zhàn)的冒險(xiǎn)之旅！

       一、引言：重組蛋白表達(dá)的 "甜蜜煩惱"

       重組蛋白表達(dá)堪稱高價(jià)值蛋白質(zhì)生產(chǎn)界的 "變革者"，從治病救人的治療藥物，到工業(yè)生產(chǎn)中的 "得力助手" 工業(yè)酶，都有它的身影。在眾多表達(dá)系統(tǒng)里，大腸桿菌憑借 "生長速度堪比火箭""遺傳特性門兒清""實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)豐富老道" 以及 "操作簡單穩(wěn)健" 等優(yōu)勢，成功 "出圈"，成為科研人員的心頭好。

       不過，大腸桿菌也有 "掉鏈子" 的時(shí)候，它表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)面臨一個(gè)超頭疼的問題 -- 不溶性聚集體，也就是咱們說的包涵體。這玩意兒就像蛋白質(zhì)世界里的 "搗蛋鬼"，直接阻礙功能性可溶蛋白質(zhì)的 "順利誕生"。雖然包涵體在蛋白質(zhì)純化時(shí)能 "幫點(diǎn)小忙"，但誰也不敢保證，在體外重折疊過程中，它能乖乖 "變身" 成大量有生物活性的產(chǎn)物。通常情況下，當(dāng)過表達(dá)的重組蛋白 "瘋狂生長"，超過大腸桿菌的 "折疊能力上限"，或者在細(xì)胞里遭遇 "惡劣環(huán)境" 時(shí)，包涵體就會 "橫空出世"。

       以前，從包涵體重新折疊蛋白質(zhì)，那可是個(gè) "費(fèi)力不討好" 的活兒，不僅過程繁瑣，產(chǎn)量還低。盡管現(xiàn)在體外重折疊技術(shù)有了不少進(jìn)步，但想從包涵體里獲得高產(chǎn)量、正確折疊的可溶性蛋白質(zhì)，依然是科研人員面前的 "一座大山"。更讓人無奈的是，文獻(xiàn)里大多只記錄成功案例，那些失敗的重折疊嘗試，就像 "隱藏的秘密"，很少被提及。

       為了攻克這個(gè)難題，科研人員開啟了 "頭腦風(fēng)暴"，想出了各種辦法來提高大腸桿菌中重組蛋白的可溶性和產(chǎn)量。比如，讓分子伴侶和重組蛋白 "組隊(duì)"，像熱休克蛋白這類分子伴侶，就是蛋白質(zhì)折疊的 "貼心小助手"，能幫忙折疊和穩(wěn)定蛋白質(zhì)。DnaK、DnaJ 和 GroEL/ES 這些分子伴侶，會和新合成的多肽鏈 "親密互動"，防止它們 "調(diào)皮搗蛋" 錯(cuò)誤折疊，努力引導(dǎo)它們 "走上正軌" 正確折疊，大大增加獲得可溶性蛋白質(zhì)的機(jī)會。

       除了分子伴侶，融合標(biāo)簽也是個(gè) "好幫手"，它既能增強(qiáng)蛋白質(zhì)可溶性，又能方便蛋白質(zhì)純化。麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)、谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶 (GST) 或多組氨酸 (His - tag) 這些標(biāo)簽，就像給蛋白質(zhì)裝上了 "穩(wěn)定器" 和 "便捷抓手"，不僅能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、防止聚集，還能為純化技術(shù)提供 "親和力手柄"。當(dāng)然，具體選哪個(gè)融合標(biāo)簽，還得根據(jù)蛋白質(zhì)的 "個(gè)性需求" 和下游應(yīng)用來決定。

       密碼子優(yōu)化也是優(yōu)化大腸桿菌中重組蛋白表達(dá)的 "關(guān)鍵一招"。大腸桿菌在密碼子使用上有自己的 "小偏好"，如果目標(biāo)基因用了大腸桿菌 "不熟悉" 的密碼子，就會導(dǎo)致翻譯 "卡殼"，蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊。密碼子優(yōu)化就像是給目標(biāo)基因 "重新裝修" DNA 序列，把大腸桿菌喜歡的密碼子 "安排" 進(jìn)去，這樣翻譯效率提高了，蛋白質(zhì)產(chǎn)量自然也能增加，蛋白質(zhì)的溶解度也有望提升。不過，凡事都有個(gè)度，如果翻譯速率 "狂飆"，反而會讓蛋白質(zhì) "手忙腳亂" 錯(cuò)誤折疊，變得不溶。

       還有個(gè)簡單粗暴的方法，就是降低誘導(dǎo)過程中的溫度，一般把溫度降到 15-25°C，甚至還有在 10°C 以下成功培養(yǎng)的 "神操作"。為了配合低溫培養(yǎng)，科研人員還專門培育出了 "抗寒小能手" 菌株，比如大腸桿菌 ArcticExpress，它和嗜冷細(xì)菌 Oleispira antarctica 中的耐寒伴侶蛋白 Cpn10 和 Cpn60 "攜手合作"，在低溫下也能 "正常工作"。

       而向培養(yǎng)基中添加添加物，更是一種能直接影響可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)水平的 "神奇魔法"。這些添加物就像 "細(xì)胞環(huán)境改造師"，能改變細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，幫助重組蛋白在細(xì)胞質(zhì)中 "優(yōu)雅地" 正確折疊，最終實(shí)現(xiàn)可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)量的 "大豐收"。本文就帶大家一起 "解鎖" 最近關(guān)于大腸桿菌培養(yǎng)添加物增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)中可溶性重組蛋白表達(dá)的研究成果，看看這些添加物是如何 "各顯神通" 的。

       二、誘導(dǎo)劑：濃度調(diào)控的 "蹺蹺板游戲"

       重組蛋白表達(dá)有兩種 "啟動方式"，要么靠自身誘導(dǎo)，要么添加誘導(dǎo)劑。按常理說，增加誘導(dǎo)劑濃度，表達(dá)產(chǎn)量應(yīng)該 "蹭蹭往上漲"，但現(xiàn)實(shí)卻很 "骨感"，表達(dá)水平提高了，包涵體這個(gè) "麻煩精" 可能就跟著來了（圖 1 A）。相反，如果降低誘導(dǎo)劑濃度，蛋白合成速率就像泄了氣的皮球，會變慢，不過包涵體的數(shù)量也會相應(yīng)減少。所以，在表達(dá)容易形成包涵體的蛋白時(shí)，就得像玩蹺蹺板一樣，巧妙地平衡誘導(dǎo)劑濃度，該增加時(shí)增加，該降低時(shí)降低。

       圖1.誘導(dǎo)劑（A）、葡萄糖/乳糖/甘油（B）、滲透壓調(diào)節(jié)劑（C）和乙醇（D）對大腸桿菌中重組蛋白表達(dá)的影響的可能機(jī)制。

       基于乳糖的啟動子系統(tǒng)，那可是表達(dá)系統(tǒng)里的 "明星選手"，研究得多，用起來也高效。不過它有個(gè)小 "毛病"，采用 "開" 或 "關(guān)" 的簡單機(jī)制，想要調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑濃度來降低酶合成速率，就像讓大象穿針一樣困難。

       IPTG 絕 對是誘導(dǎo)劑界的 "大紅人"，使用范圍超廣，效果也很給力。一般來說，增加 IPTG 的濃度，活性酶形式的產(chǎn)量確實(shí)能提高。但 IPTG 也是個(gè) "雙刃劍"，濃度太高會 "欺負(fù)" 大腸桿菌，抑制它的生長。有意思的是，降低 IPTG 的濃度，有時(shí)候反而能提高可溶性蛋白表達(dá)的產(chǎn)量。比如，把 IPTG 濃度從 1.2 mM 降低到 0.3 mM，重組牛性別決定區(qū) Y 蛋白的可溶形式產(chǎn)量就提高了；在鉤端螺旋體蛋白的表達(dá)中，IPTG 濃度為 0.1 mM 時(shí)，可溶性蛋白產(chǎn)量最高，大腸桿菌也 "長得最歡"；研究核因子 κB 受體激活劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.3 mM IPTG 時(shí)表達(dá)量最大；對于上皮細(xì)胞粘附分子胞外結(jié)構(gòu)域融合硫氧還蛋白，0.5 mM IPTG 時(shí)蛋白產(chǎn)量達(dá)到巔峰。還有黃色熒光蛋白，它的合成率對 IPTG 濃度 "不敏感"，但降低 IPTG 濃度會讓蛋白質(zhì)合成前的等待時(shí)間變長。甚至可以把IPTG 濃度降到 0.1 mM 以下，故意拉長誘導(dǎo)過程中的延遲。不過，也有 "意外情況"，有時(shí)候優(yōu)化 IPTG 濃度，對蛋白質(zhì)表達(dá)水平?jīng)]啥影響。

       科研人員為了更好地控制 IPTG 誘導(dǎo)，對 BL21 (DE3) 表達(dá)菌株進(jìn)行了 "改造升級"，引入 lacY1 缺失突變，讓 T7 啟動子系統(tǒng)變得更加 "聽話"，能對不同濃度的 IPTG 做出精細(xì)反應(yīng)。大腸桿菌 Tuner (DE3) 菌株也很厲害，它含有l(wèi)acZY 缺失，能精準(zhǔn)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)水平，在某些情況下，還能助力可溶性蛋白質(zhì)的 "誕生"。不過，目前使用 Tuner (DE3) 菌株并優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度的研究還不算多。在環(huán)麥芽糊精酶表達(dá)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)里，IPTG 濃度在 5 μM 到 1 mM 之間 "試探"，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 50 μM 濃度時(shí)表達(dá)產(chǎn)量最高。

       另一個(gè)常用的啟動子是來自 araBAD 操縱子的 pBAD 啟動子，它能讓大腸桿菌細(xì)胞 "學(xué)會" 運(yùn)輸和代謝阿拉伯糖。這個(gè)系統(tǒng)屬于正向控制，基礎(chǔ)表達(dá)水平比較低，對于那些 "毒性十足" 的蛋白質(zhì)來說，簡直是 "救命稻草"。用 pBAD啟動子時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)水平和阿拉伯糖濃度 "關(guān)系密切"，濃度變化能讓表達(dá)水平相差兩個(gè)數(shù)量級，就像給蛋白質(zhì)表達(dá)量裝上了一個(gè) "超級變變變" 的開關(guān)，可以在很寬的阿拉伯糖濃度范圍內(nèi)隨意調(diào)節(jié)。不過，它也有個(gè)小 "bug"，在低阿拉伯糖濃度下，會出現(xiàn) "分裂" 現(xiàn)象，產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞和非生產(chǎn)細(xì)胞兩個(gè) "小團(tuán)體"，這時(shí)候表達(dá)水平下降，可不是因?yàn)槊负铣伤俾首兟巧a(chǎn)細(xì)胞數(shù)量變少了。當(dāng)用葡萄糖作為碳源、阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑時(shí)，還會出現(xiàn)分解代謝物抑制效應(yīng)，而且葡萄糖的 "抑制威力" 比甘油還大。不過，咱們可以 "將計(jì)就計(jì)"，利用這個(gè)效應(yīng)來優(yōu)化誘導(dǎo)系統(tǒng)和自誘導(dǎo)系統(tǒng)中碳源的類型和濃度。

       三、葡萄糖、乳糖和甘油：碳源界的 "三國演義"

       葡萄糖在大腸桿菌培養(yǎng)界，那可是 "老熟人" 了，容易獲取，使用廣泛。但它就像個(gè) "調(diào)皮的孩子"，在培養(yǎng)基中添加葡萄糖，常常會讓重組蛋白的表達(dá)率 "直線下降"，這就是傳說中的分解代謝抑制效應(yīng)。往培養(yǎng)基里加 1% 的葡萄糖，大腸桿菌 BL21 (DE3) 細(xì)胞的誘導(dǎo)性就會大幅降低。不過，表達(dá)率降低也不完全是壞事，有時(shí)候反而能提高可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)量，這對于表達(dá)高毒性蛋白質(zhì)來說至關(guān)重要，因?yàn)槟呐率堑退奖磉_(dá)，也可能讓細(xì)胞 "不堪重負(fù)"，在達(dá)到理想細(xì)胞密度前就 "夭折"。通過優(yōu)化初始葡萄糖濃度，重組干擾素 α - 2b 的產(chǎn)量能提高 2 倍多，研究發(fā)現(xiàn)，最佳葡萄糖濃度是 2% (20 g/L)，要是濃度再增加，蛋白質(zhì)產(chǎn)量就會 "一落千丈"。

       大腸桿菌在利用葡萄糖的過程中，還會產(chǎn)生乳酸和醋酸鹽這些 "討人嫌" 的副產(chǎn)物，它們就像細(xì)胞生長和重組蛋白產(chǎn)生道路上的 "絆腳石"，會抑制細(xì)胞生長和重組蛋白的合成。就算用了緩沖系統(tǒng)，添加葡萄糖還是會讓 pH 值 "暴跌"，導(dǎo)致細(xì)胞 "停止生長"(圖 1 B)。在 M9 培養(yǎng)基中加 2% 葡萄糖和 66 mM 磷酸鹽緩沖液，pH 值下降，細(xì)胞生長速度明顯變慢。所以，高葡萄糖濃度可不是個(gè)好選擇。不過，要是非得用高葡萄糖濃度，也有 "補(bǔ)救措施"，可以添加琥珀酸、富馬酸、天冬氨酸或谷氨酸，或者在生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)控制 pH 值，來減輕 pH 值降低帶來的負(fù)面影響。

       在自誘導(dǎo)系統(tǒng)里，優(yōu)化葡萄糖濃度更是 "重中之重"。自誘導(dǎo)系統(tǒng)的原理就像一場 "接力賽"，某些化合物會先 "攔住" 乳糖誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白，等葡萄糖儲備 "消耗殆盡"，乳糖代謝就會 "接棒"，觸發(fā)誘導(dǎo)。甘油也是個(gè) "得力選手"，可以作為額外的碳源，在葡萄糖用完后，能和乳糖一起被代謝，而且它抑制細(xì)胞使用其他碳源的能力比葡萄糖弱很多，還能減少 pH 酸化。所以，在自誘導(dǎo)系統(tǒng)中，葡萄糖、甘油和乳糖常常 "組團(tuán)出道"。

       自誘導(dǎo)系統(tǒng)有個(gè)超厲害的優(yōu)勢，能讓細(xì)胞在開始誘導(dǎo)前 "瘋狂生長"，達(dá)到高密度。和 IPTG 誘導(dǎo)相比，用自誘導(dǎo)系統(tǒng)往往能收獲更高的產(chǎn)量。比如，使用 ZYM- 20052 自誘導(dǎo)培養(yǎng)基（2.5% 甘油、0.05% 葡萄糖和 0.2% 乳糖），研究的三種蛋白質(zhì)中，有一種的可溶形式產(chǎn)量比用營養(yǎng)豐富的 Dynamite 培養(yǎng)基和 IPTG 誘導(dǎo)時(shí)高很多。像含有 0.5% 甘油、0.05% 葡萄糖和 0.2% 乳糖的 5052培養(yǎng)基，在各種生長條件下，都能助力多種蛋白質(zhì)的自誘導(dǎo)。

       不過，自誘導(dǎo)系統(tǒng)也有 "小脾氣"，改變通氣條件時(shí)，就需要優(yōu)化培養(yǎng)基成分。因?yàn)樵谑褂米哉T導(dǎo)系統(tǒng)時(shí)，通氣水平太高，表達(dá)量反而會降低。在高通氣條件下，就得把乳糖濃度增加到約 0.5%，甘油濃度增加到約 0.8%，高濃度的甘油和乳糖還能通過滲透沖擊提高表達(dá)產(chǎn)量。自誘導(dǎo)系統(tǒng)還能和 BL21 - AI 細(xì)胞中的 pBAD 啟動子 "強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合"，這時(shí)候，可以用 0.05% L - 阿拉伯糖代替 0.2%乳糖，作為優(yōu)化的起始濃度。

       四、滲透調(diào)節(jié)劑和滲透保護(hù)劑

       在原核生物蛋白質(zhì)的 "細(xì)胞質(zhì)大舞臺" 上，有幾位 "明星救場選手"-- 熱休克蛋白 DnaK/DnaJ/GrpE、GroEL/ES 和 ClpB，它們組成的解聚系統(tǒng)堪稱目前研究界的 "頂流天團(tuán)"。當(dāng)細(xì)胞遭遇滲透休克這個(gè) "大危機(jī)" 時(shí)，這些熱休克蛋白瞬間開啟 "加班模式"，瘋狂加量表達(dá)。畢竟，分子伴侶蛋白合成 "火力全開"，咱有理由相信，在這場 "危機(jī)" 中，可溶性重組蛋白的表達(dá)水平也會跟著 "蹭蹭" 往上漲（見圖 1 C，這可是有 "實(shí)錘證據(jù)" 的?。?。

       非嗜鹽菌面對高鹽濃度這個(gè) "惡霸" 時(shí)，有自己的一套 "生存智慧"。它們會悄悄積攢滲透保護(hù)劑或者相容性溶質(zhì)，就像小動物儲存過冬糧食一樣，為的就是防止水分被滲透壓這個(gè) "大怪獸" 搶走。相容性溶質(zhì)這玩意兒，堪稱細(xì)胞內(nèi)的 "模范居民"，它們能在細(xì)胞里安心 "定居"，還不會干擾細(xì)胞內(nèi)部的各種 "生化派對"。你看，在高滲透壓培養(yǎng)基里 "生活" 的大腸桿菌，就瘋狂 "囤貨" 甘氨酸 - 甜菜堿。還有研究發(fā)現(xiàn)，在滲透脅迫這個(gè) "艱難時(shí)刻"，甘氨酸甜菜堿和脯氨酸甜菜堿就像 "能量飲料"，能刺激大腸桿菌細(xì)胞 "活力滿滿" 地生長。不過，細(xì)胞自己生產(chǎn)滲透保護(hù)劑可是個(gè) "燒錢" 的活兒，所以通常都得在培養(yǎng)基里 "投喂" 它們。

       在大腸桿菌重組蛋白表達(dá)這場 "大戲" 里，NaCl 和山梨醇是常用的 "劇情推手"，專門負(fù)責(zé)制造滲透脅迫。而甘氨酸甜菜堿穩(wěn)坐 "最 受歡迎滲透保護(hù)劑" 的寶座。大量研究甩出 "鐵證"，證明滲透壓休克就是提高大腸桿菌中難溶性酶表達(dá)水平的 "秘密武器"。Oganesyan 的研究就像一場 "魔法實(shí)驗(yàn)"，在 LB培養(yǎng)基里加入 0.5 M NaCl 和 1 mM 甜菜堿后，9 種蛋白質(zhì)里有 6 種的表達(dá)都 "支棱起來" 了。在 37°C 時(shí)，加入 660 mM 山梨醇和 2.5 mM 甜菜堿，二甲基烯丙基焦磷酸：5'-AMP 二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量直接 "飆升" 2.4 倍；到了 25°C，同樣的 "配方"，產(chǎn)量更是夸張地增加 6.5 倍。就算只加 500 mM 山梨醇（不搭配甜菜堿這位 "黃金搭檔"），8 種酶里也有 3 種的可溶性形式增加了 1.5 到 2 倍左右。和分子伴侶 "組隊(duì)"，再補(bǔ)充 0.5M 山梨醇，轉(zhuǎn)化生長因子 β3 的產(chǎn)量也能 "更上一層樓"。1 M 海藻糖更是 "神來一筆"，能讓產(chǎn)量進(jìn)一步提高。不過，乙二醇、鹽酸精氨酸和蔗糖這些"選手" 就有點(diǎn) "不給力"，完全沒法提高可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。

       除了 NaCl 和山梨醇，高濃度的甘油和精氨酸也是滲透休克 "劇組" 的 "?？?。0.4% 的甘油就像 "神奇調(diào)料"，能讓人類苯丙氨酸羥化酶野生型和突變型酶的產(chǎn)量 "更美味"。在表達(dá) N 端和 SUMO 標(biāo)簽 "手拉手" 融合的白喉毒素變體時(shí)，200 mM 的山梨醇就是 "最佳濃度"。0.3 M 山梨醇或 0.2 M 精氨酸一出場，可溶性蛋白產(chǎn)量立馬 "漲姿勢"。2% 甘油或 0.2 M 山梨醇也不甘示弱，能讓活性膽固醇氧化酶的產(chǎn)量 "節(jié)節(jié)高"。0.5 M 山梨醇和 0.2 M 精氨酸聯(lián)手，還能增加 GFP 活性包涵體的數(shù)量。不過，滲透調(diào)節(jié)劑和滲透保護(hù)劑也不是 "萬能鑰匙"，有時(shí)候也會 "翻車"。比如，加了 2.5 mM 甜菜堿或 600 mM 山梨醇，鞘氨醇菌 MTA144 的氨基轉(zhuǎn)移酶就是 "不愿意" 以可溶形式"露面"。甜菜堿面對卟啉原 IX 氧化酶，也是 "束手無策"，完全沒法提高它的表達(dá)水平。更離譜的是，在人類血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體這里，1 M 山梨醇和 250 mM 甜菜堿一 "搗亂"，膜蛋白產(chǎn)量直接 "暴跌"。研究人員還拿腸炎沙門氏菌 "做實(shí)驗(yàn)"，發(fā)現(xiàn) 200 mM 山梨醇能讓可溶性鞭毛蛋白產(chǎn)量 "大爆發(fā)"，100 mM 和 250 mM 精氨酸也能帶來類似的 "驚喜"?？磥恚瑵B透調(diào)節(jié)劑提高可溶性酶表達(dá)水平，可能不只是激活分子伴侶表達(dá)這么簡單，像山梨醇、甘油和海藻糖這些 "高手"，本身就是蛋白質(zhì)的 "貼心保鏢"，能阻止蛋白質(zhì)從天然構(gòu)象 "誤入歧途"，變成未折疊或錯(cuò)誤折疊的 "奇怪模樣"。

       五、乙醇：蛋白質(zhì)表達(dá)界的 "叛逆選手"

       在提高可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)水平的 "方法大軍" 里，乙醇絕 對是個(gè) "叛逆選手"。它一加入細(xì)菌 "大家庭"，細(xì)菌就像被按下了 "混亂按鈕"，蛋白質(zhì)和離子從細(xì)胞膜 "瘋狂逃竄"，膜通透性也跟著 "失控"。不過，蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這 "搗亂分子" 居然能讓熱休克蛋白的數(shù)量 "瘋狂擴(kuò)招"（見圖 1 D）。而且，好多和碳水化合物合成、運(yùn)輸有關(guān)的蛋白質(zhì)，在乙醇的 "刺激" 下，表達(dá)量也 "一路狂飆"。碳水化合物可是大多數(shù)蛋白質(zhì)的 "忠實(shí)守護(hù)者"，它們水平一改變，可溶性表達(dá)產(chǎn)量自然也能 "沾光"。轉(zhuǎn)錄組分析還發(fā)現(xiàn)，乙醇會引發(fā)氧化應(yīng)激，讓細(xì)菌的缺氧和有氧代謝 "集體擺爛"，大分子生物合成速度變慢，反而減少了錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的數(shù)量。不過，和滲透劑、滲透保護(hù)劑這些 "熱門選手" 相比，成功用乙醇獲得可溶性蛋白質(zhì)形式的研究數(shù)量，簡直就是 "小透明"。一般來說，在培養(yǎng)基里加 3% 乙醇就差不多了。加了乙醇，雷珠單抗的產(chǎn)量直接 "翻倍"；3% 乙醇還能讓 6 種檢測蛋白質(zhì)里的 4 種表達(dá)水平 "原地起飛"。在培養(yǎng)融合蛋白 preS2 - S'-b - 半乳糖苷酶時(shí)，3%乙醇在 30°C 和 42°C 誘導(dǎo)期間就是 "神隊(duì)友"，能提高培養(yǎng)產(chǎn)量，可到了 37°C 就 "罷工" 了。在 37°C 時(shí)，乙醇對 CT26 - 多新表位的產(chǎn)量 "愛答不理"，22°C 時(shí)，2% 乙醇又能讓表達(dá)產(chǎn)量 "支棱起來"。20°C 時(shí)，3% 乙醇讓傳染性造血細(xì)胞壞死病毒核蛋白在可溶性和不溶性部分的總量 "蹭蹭漲"。不過，原卟啉原 IX 氧化酶面對乙醇，完全是 "不為所動"，表達(dá)水平一點(diǎn)都不變。

       六、輔因子：蛋白質(zhì)表達(dá)的 "能量補(bǔ)給站"

       各種帶輔基的酶，就像需要 "燃料" 的汽車，得有足夠的相應(yīng)輔因子或其前體才行。給它們 "喂飽" 輔因子，產(chǎn)量就能 "一路開掛"。不過，好多輔因子價(jià)格太貴，簡直就是 "奢侈品"，這時(shí)候就可以用輔因子的代謝前體來 "平替"。在重組人血紅蛋白表達(dá)這場 "比賽" 中，血紅素就是 "秘密武器"，一添加，可溶性蛋白質(zhì)的量就 "蹭蹭" 往上漲。硫胺素和 δ - 氨基乙酰丙酸也能給含血紅素蛋白質(zhì)的表達(dá) "加油打氣"。但在重組細(xì)胞色素 P450 1B1 表達(dá)時(shí)，硫胺素就 "不給力" 了，δ - 氨基乙酰丙酸濃度高達(dá) 1 mM 時(shí)，蛋白質(zhì)產(chǎn)量才能 "顯著增加"。培養(yǎng)源自大腸桿菌 K12 的菌株時(shí)，硫胺素就是 "救命稻草"，因?yàn)檫@些菌株可能缺了合成硫胺素的 "關(guān)鍵裝備"-- 相關(guān)酶。在表達(dá)含 FAD 的原卟啉原氧化酶時(shí)，誘導(dǎo)前 2 小時(shí)加 1 ?M 核黃素，回收的酶量直接 "翻 4 倍"。大腸桿菌 BL21（源自大腸桿菌 B）比大腸桿菌 MG1655（類似大腸桿菌 K - 12）更愛 "囤貨" 核黃素，這可能和核黃素跨膜輸入系統(tǒng)（大腸桿菌里的 YpaA 蛋白）以及內(nèi)源性核黃素生物合成途徑有關(guān)。而且，添加輔因子可不只是增加溶解度這么簡單，還能提高比酶活性。0.02 mM 磷酸吡哆醛（5 - 磷酸吡哆醇）一 "上場"，活性谷氨酸脫羧酶的產(chǎn)量直接增加 2 到 2.5 倍，比活性也 "翻倍"。吡哆醇能被大腸桿菌 "吃進(jìn)去"，用來合成磷酸吡哆醛。吡哆醇濃度高于 0.05 mM 時(shí)，活性谷氨酸脫羧酶產(chǎn)量增加近 1.8 倍，比活性增加 1.5 倍，穩(wěn)定性還提高 2.8 倍。不過，維生素添加物也不是 "百發(fā)百中"，1 mM 濃度的磷酸吡哆醛（氨基轉(zhuǎn)移酶 FumI 的輔酶）加進(jìn)培養(yǎng)基，完全 "沒效果"。0.1 M FAD、FMN 和核黃素添加到培養(yǎng)基里，對人類 D - 氨基酸氧化酶的表達(dá)產(chǎn)量也是 "無計(jì)可施"。

       七、優(yōu)化：打造蛋白質(zhì)表達(dá)的 "最佳劇本"

       綜合分析這些提高表達(dá)水平的 "奇招妙法"，我們想出了一個(gè)簡單又通用的 "劇本"，專門用來優(yōu)化培養(yǎng)基添加物，讓可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)量 "一飛沖天"（見圖 2）。

       第一步就是給誘導(dǎo)系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑濃度，或者自誘導(dǎo)系統(tǒng)的乳糖 / 葡萄糖 / 甘油成分比例 "調(diào)調(diào)參數(shù)"。根據(jù)文獻(xiàn) "情報(bào)"，不同的目標(biāo)蛋白質(zhì)，最佳誘導(dǎo)劑濃度都不一樣。所以，我們建議先在一個(gè)較大的誘導(dǎo)劑濃度范圍里 "海選"，要是找到合適的，再慢慢縮小范圍。要是用 IPTG 誘導(dǎo)，濃度可以在0.1 到 1.0 mM 之間 "試試看"。用自誘導(dǎo)系統(tǒng)的話，可以從 5052 等培養(yǎng)基入手，補(bǔ)充 0.5% 甘油、0.05% 葡萄糖和 0.2% 乳糖。為了少做實(shí)驗(yàn)，還能同時(shí)大范圍改變每種成分，來個(gè) "并行優(yōu)化"。比如，設(shè)計(jì) 9 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，分別測試添加 0.2%、0.5% 和 1.0% 的甘油，0.02%、0.05% 和 0.1% 的葡萄糖，以及 0.1%、0.2% 和 0.5% 的乳糖，其他成分保持不變，這樣就能快速找到 "最佳配方" 啦！

       圖2.優(yōu)化添加物的方案。

       第二步：給大腸桿菌 "開盲盒"-- 試試神奇添加物組合，接下來咱們要開啟 "實(shí)驗(yàn)室盲盒挑戰(zhàn)"，同時(shí)測試滲透調(diào)節(jié)劑、滲透保護(hù)劑和乙醇這幾位 "神秘嘉賓" 的效果！

       先說說滲透調(diào)節(jié)劑界的 "三劍客"：0.5 M 山梨醇、0.5 M 氯化鈉和 2% 甘油。山梨醇在滲透休克界堪稱 "頂流明星"，文獻(xiàn)里到處都是它的 "粉絲"。不過，氯化鈉和甘油兩位 "平替選手" 也毫不遜色，不僅價(jià)格親民，在實(shí)驗(yàn)室的 "試劑貨架" 上更是一抓一大把，妥妥的 "性價(jià)比之王"！

       滲透保護(hù)劑里，2.5 mM 甜菜堿就是那位 "貼心小棉襖"。要是不巧實(shí)驗(yàn)室甜菜堿 "斷貨" 了，咱也別慌，直接測試沒有它幫忙的滲透調(diào)節(jié)劑效果，說不定會有意外驚喜！

       輪到乙醇這位 "氣氛組組長" 登場了，建議用 3% 的濃度來 "激活" 大腸桿菌。要是這幾位添加物里有誰能讓蛋白質(zhì)表達(dá)量 "蹭蹭" 往上漲，那必須給它 "加雞腿"-- 進(jìn)一步優(yōu)化濃度！

       要是研究的蛋白質(zhì)自帶 "專屬輔助" 輔因子，也可以考慮優(yōu)化輔因子或者它的 "前同事" 代謝前體。不過這些 "高端玩家" 價(jià)格可不便宜，建議留到優(yōu)化的"最終關(guān)卡" 再請它們出山。一旦發(fā)現(xiàn)它們能讓蛋白質(zhì)產(chǎn)量 "起飛"，就趕緊調(diào)整用量，榨干它們的 "潛力"！而且別擔(dān)心，這套優(yōu)化方案主打一個(gè) "簡單粗暴"，不用瘋狂做實(shí)驗(yàn)就能搞定！

       結(jié)論和未來展望：解鎖大腸桿菌的 "隱藏技能"

       在分子生物學(xué)和生物技術(shù)的 "蛋白質(zhì)生產(chǎn)大賽" 里，提高可溶性重組蛋白的產(chǎn)量可是個(gè) "終極任務(wù)"。往培養(yǎng)基里加點(diǎn) "魔法試劑"，絕 對是最簡單直接的 "作弊攻略"！

       要說最火的 "參賽選手"，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)必須擁有姓名。這篇綜述就像一本"大腸桿菌蛋白生產(chǎn)秘籍"，把能用的添加物技巧扒了個(gè)底朝天！最熱門的操作就是調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度，還有給大腸桿菌來場 "滲透休克"。研究數(shù)據(jù)顯示，差不多一半的實(shí)驗(yàn)在滲透休克后，蛋白質(zhì)產(chǎn)量都 "原地起飛"，效果堪比給大腸桿菌請了個(gè) "分子伴侶私教"！

       相比之下，研究乙醇對蛋白質(zhì)表達(dá)影響的就有點(diǎn) "小眾" 了。要是能來場大型 "試劑 PK 賽"，對比各種滲透劑、乙醇和其他添加物對不同蛋白質(zhì)的影響，那場面得多精彩！可惜現(xiàn)在大多數(shù)研究都在 "單打獨(dú)斗"，研究單一添加物的效果，還沒人試過 "豪華套餐"-- 多種添加物組合會擦出怎樣的火花，簡直讓人好奇到撓墻！

       溫度這個(gè) "幕后大佬" 也不容忽視，降低溫度就像給滲透調(diào)節(jié)劑和乙醇 "開了外掛"，讓它們的效果直接翻倍！不過殘酷的現(xiàn)實(shí)是，目前還沒有 "預(yù)言家" 能提前知道添加物的效果，所以最靠譜的辦法就是挨個(gè)測試那些 "爆款添加物"。

       未來可期！隨著實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)越來越多，咱們對大腸桿菌 "生活習(xí)性" 了解得越來越深，說不定哪天就能發(fā)現(xiàn)新的 "寶藏添加物"，讓蛋白質(zhì)產(chǎn)量直接 "突破天際"！代謝工程這個(gè) "黑科技領(lǐng)域" 也在瘋狂發(fā)力，說不定哪天就能給大腸桿菌定制專屬代謝途徑，讓它變身 "蛋白生產(chǎn)永動機(jī)"！

       大腸桿菌重組蛋白表達(dá)可是分子生物學(xué)和生物技術(shù)的 "基本功"，這篇綜述一口氣盤點(diǎn)了五大 "上分技巧"：

       誘導(dǎo)劑優(yōu)化：給誘導(dǎo)劑調(diào)個(gè) "黃金濃度"，讓蛋白質(zhì)瘋狂 "營業(yè)"！

       自誘導(dǎo)系統(tǒng)優(yōu)化：研究葡萄糖、乳糖和甘油的 "最佳配比"，打造蛋白質(zhì)高產(chǎn) "生產(chǎn)線"。

       滲透調(diào)節(jié)劑和滲透保護(hù)劑：山梨醇、甘氨酸甜菜堿等 "抗壓小能手"，幫大腸桿菌輕松應(yīng)對滲透壓力，提高蛋白質(zhì)溶解度。

       乙醇添加物：看乙醇如何 "拿捏" 大腸桿菌，挖掘它改善蛋白質(zhì)表達(dá)的 "隱藏實(shí)力"。

       輔因子和代謝前體：揭秘輔因子和代謝前體的 "增強(qiáng)魔法"，給特定蛋白質(zhì)來場 "專屬 Buff"。

       這篇綜述不僅總結(jié)了成功經(jīng)驗(yàn)，還把研究路上的 "絆腳石" 攤開來講，順便指了指未來研究的 "新方向"。想要在生物技術(shù)領(lǐng)域 "大殺四方"，高效生產(chǎn)重組蛋白，這些知識點(diǎn)必須 "刻進(jìn) DNA"！而且，基于前面的分析，咱們還量身定制了一套超簡單的培養(yǎng)基添加物優(yōu)化方案，手把手教你玩轉(zhuǎn)大腸桿菌蛋白生產(chǎn)！

       原文：D.L.Atroshenko, E.P.Sergeev, D.I.Golovina, et al., Additivities for Soluble Recombinant Protein Expression in Cytoplasm of Escherichia coli. Fermentation, 2024.