蛋白質定向進化是生物技術領域的重要工具，通過模擬自然進化過程，在實驗室中快速優(yōu)化蛋白質功能。然而，傳統(tǒng)方法如易錯 PCR 存在耗時長、效率低、突變庫多樣性受限等問題。
近年來，基于 CRISPR-Cas 或 T7 RNA 聚合酶的突變系統(tǒng)雖取得進展，但仍面臨突變范圍小、宿主普適性窄等挑戰(zhàn)。在非模式生物（例如嗜鹽單胞菌 Halomonas bluephagenesis）中，缺乏高效的蛋白質定向進化工具，限制了其在工業(yè)生物技術中的應用。如何開發(fā)一種高效、高特異性、廣宿主兼容且能同時引入多種突變類型的系統(tǒng)，成為亟待解決的難題。
近日，清華大學陳國強教授團隊在 Nature Communications 期刊發(fā)表了題為：An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo 的研究論文。
該開發(fā)了一種正交轉錄突變系統(tǒng)（OTM）。該系統(tǒng)通過將三種廣宿主兼容性的噬菌體 RNA 聚合酶（MmP1/K1F/VP4）與兩種脫氨酶（PmCDA1 和 TadA 變體）巧妙融合，構建了一個高效、模塊化的蛋白質進化平臺。其核心設計原理在于：RNA 聚合酶在轉錄過程中解旋 DNA 形成單鏈區(qū)，而融合的脫氨酶則能對暴露的單鏈 DNA 進行編輯，實現(xiàn) C:G-T:A 和 A:T-G:C 類型的堿基突變。該系統(tǒng)能在短短 1 天內完成蛋白質的定向進化，突變效率較自發(fā)突變提升達 150 萬倍。
在這項研究中，研究團隊采用 XTEN 柔性連接肽分別將胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶與噬菌體 RNA 聚合酶融合，構建了分別能夠產生 C:G-T:A 和 A:T-G:C 類型堿基突變的正交轉錄突變元件。同時通過添加尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）和優(yōu)化誘導條件，使突變效率提升 150 萬倍，而脫靶率僅增加 65 倍。
進一步，通過將兩種脫氨酶與噬菌體 RNA 聚合酶進行合理組合，研究團隊構建了能夠同時引入 C:G-T:A 和 A:T-G:C 突變的雙功能正交轉錄突變元件。通過在目標基因上下游分別插入噬菌體啟動子，研究人員成功實現(xiàn)了突變在目標基因上的均勻分布，克服了單個啟動子策略中突變偏向啟動子近端的局限性。
此外，正交性實驗結果表明，基于不同噬菌體 RNA 聚合酶的正交轉錄突變元件能夠特異性識別各自啟動子，避免交叉干擾，從而為之后的模塊化設計提供可能。在宿主適用性方面，該系統(tǒng)在非模式生物（例如嗜鹽單胞菌 Halomonas bluephagenesis）和模式生物（例如大腸桿菌 E.coli）中均表現(xiàn)出色，解決了現(xiàn)有工具在非模式生物中效率低下的難題。
在實際應用方面，該系統(tǒng)展現(xiàn)了強大的潛力。研究團隊通過突變熒光蛋白和色素蛋白，成功獲得具有多種不同顏色的細胞；通過靶向突變細胞骨架和分裂相關蛋白，獲得了具有超長桿狀、球形和其他多種形狀的工程菌株，為形態(tài)學工程改造提供新的思路；在工業(yè)應用場景下，通過一輪突變進化 σ70 全局轉錄調控因RpoD和賴氨酸外排蛋白 LysE，成功獲得能夠增強 L-精氨酸耐受性和轉運能力的突變體。
圖1. 正交轉錄突變系統(tǒng)的設計、優(yōu)化與應用
總的來說，該研究開發(fā)的正交轉錄突變系統(tǒng)具有高突變效率、高特異性和低脫靶率的優(yōu)點，在實際進化過程中僅用 1 天即可完成以往需要數(shù)周才能實現(xiàn)的蛋白質優(yōu)化過程。特別值得關注的是，該系統(tǒng)在模式和非模式生物中均展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，有效解決了現(xiàn)有工具在非模式工業(yè)菌株中應用受限的困境。
展望未來，該技術仍有廣闊的拓展空間和應用前景。一方面可以嘗試整合其他突變類型的脫氨酶，進一步豐富突變庫的多樣性；另一方面可以探索該系統(tǒng)在其他非模式生物中的兼容性和適用性。在應用層面，該突變系統(tǒng)可以應用于加速生物制造（例如 PHA 生產）中關鍵酶的優(yōu)化，推動綠色生物經濟發(fā)展。
清華大學生命科學學院陳國強教授為論文通訊作者，生命學院 2022 級博士生邵明威為本論文第一作者。其他作者還包括陳國強實驗室的科研助理張忠楠，博士后金曉帆和2023級博士生丁軍。相關工作獲得了國家自然科學基金和清華北大生命聯(lián)合中心的基金支持。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-025-61354-4
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