RNA藥物旨在通過基因的表達(dá)、沉默等功能治療疾病，基因治療被業(yè)界認(rèn)為是繼化學(xué)小分子藥物、生物大分子藥物之后的第三代治療藥物。寡核苷酸由人工合成小于100 nt (nucleotides)的修飾RNA或DNA單鏈或雙鏈，包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、微小RNA (miRNA)、適配體(Aptamer)、未甲基化CpG的寡核苷酸等。由于siRNA藥物療效較好、技術(shù)取得突破，目前最受關(guān)注。siRNA是一類雙鏈RNA分子，長(zhǎng)度為20-25個(gè)堿基對(duì)， 通過與體內(nèi)相關(guān)酶形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex,RISC）降解目標(biāo)mRNA，調(diào)低或抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。

       目前批準(zhǔn)的5款siRNA上市藥物總結(jié)如下。5款siRNA上市藥物，其中有四款來自Alnylam公司，Inclisiran是Alnylam 轉(zhuǎn)讓給諾華。治療領(lǐng)域主要位內(nèi)分泌于代謝、神經(jīng)、泌尿、心血管系統(tǒng)，靶向均是肝臟，除了Onpattro給藥方式為靜脈輸注，其它均為皮下注射，均進(jìn)行了核糖修飾和/或骨架修飾，除了Onpattro遞送方式為L(zhǎng)NP，其它均為GalNAc，分子量為14或17kD。

       圖1 五款siRNA上市藥物（截止2023.11）

       已上市的5款siRNA藥物均使用了化學(xué)修飾和遞送系統(tǒng)。因siRNA自身的物理化學(xué)特性，未經(jīng)修飾的游離寡核苷酸類藥物在給藥后不僅會(huì)很快被機(jī)體清除，同時(shí)還有脫靶和產(chǎn)生毒副作用的風(fēng)險(xiǎn)。因此需要同時(shí)借助化學(xué)修飾和合適的遞送系統(tǒng)來達(dá)到治療目的。關(guān)于化學(xué)修飾，第一代化學(xué)修飾是對(duì)磷酸骨架的修飾，如硫代磷酸酯（PS）。第二代化學(xué)修飾是核糖修飾，其中2-O-甲基（2-OMe）、2-O-甲氧基-乙基（2-MOE）和2-氟（2-F）修飾是最常用的類型。第三代化學(xué)修飾為核糖五元環(huán)改造，總結(jié)如下：

       圖2 siRNA化學(xué)修飾

       單純通過化學(xué)修飾還是很難使siRNA到達(dá)靶部位。因此，遞送系統(tǒng)成了寡核苷酸藥物研發(fā)中成功的關(guān)鍵，也是藥物研發(fā)公司的技術(shù)護(hù)城河。目前已上市的5款siRNA藥物，使用的遞送系統(tǒng)為L(zhǎng)NP（左圖）和GalNAc（右圖）。LNP主要由五部分組成：可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂、PEG-脂質(zhì)。其中，電離陽(yáng)離子脂質(zhì)是最關(guān)鍵的輔料，是siRNA遞送的決定性因素。它在不同的pH條件下表現(xiàn)出不同的帶電特征，在酸性pH值條件下帶正電荷，而在生理pH條件下基本呈中性。脂材的可離子化特性為siRNA跨越生物屏障提供了智能化的保護(hù)。目前已上市的4款GalNAc-siRNA偶聯(lián)物均使用L96作為載體，結(jié)構(gòu)均由3部分組成，分別為三觸GalNAc靶頭、連接臂以及siRNA分子。GalNAc以三價(jià)態(tài)的方式共價(jià)偶聯(lián)至核酸3'末端，形成GalNAc-siRNA偶聯(lián)物。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 的配體，ASGPR在肝細(xì)胞的膜表面高度特異性表達(dá)。GalNAc-siRNA偶聯(lián)物通過特異性結(jié)合ASGPR，在內(nèi)吞作用下，將siRNA從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中。 隨后GalNAc-siRNA偶聯(lián)物與ASPGR分離，ASPRGR回到細(xì)胞表面，而GalNAc-siRNA偶聯(lián)物進(jìn)一步解離，釋放出的游離siRNA在細(xì)胞質(zhì)中沉默基因發(fā)揮藥效。

       圖3 遞送系統(tǒng)LNP, GalNAc

       寡核苷酸是化學(xué)合成藥物，雖具備生物制品屬性，但按新化學(xué)實(shí)體監(jiān)管。寡核苷酸按新化學(xué)實(shí)體監(jiān)管，不僅人們的科學(xué)認(rèn)知尚存在一些缺口，從新藥注冊(cè)申報(bào)的角度，也存在一些監(jiān)管指南空缺。目前國(guó)內(nèi)尚無相關(guān)指導(dǎo)原則。除了ICH 系列指導(dǎo)原則外（ICH S6/M3/S7/S2）, 日本PMDA 2020年發(fā)布了《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》可供參考；FDA也發(fā)布了用于工業(yè)界的相關(guān)指導(dǎo)原則，如寡核苷酸治療藥物開發(fā)的臨床藥理學(xué)考慮等。根據(jù)日本藥監(jiān)局2020年發(fā)布的《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評(píng)價(jià)》指導(dǎo)原則，siRNA藥物種屬選擇策略如下。目前已上市的5款siRNA，種屬均是大鼠、食蟹猴。非嚙齒動(dòng)物選猴的主要原因如下：猴和人的目標(biāo)mRNA具有高度或完全同源性，猴種屬可以更好地評(píng)估siRNA放大的藥理學(xué)效應(yīng)。

       圖4 種屬選擇

       根據(jù)已上市的5款siRNA藥物，臨床前安評(píng)總結(jié)如下。

       圖5 五款siRNA藥物臨床前安評(píng)總結(jié)

       以遞送系統(tǒng)LNP藥物Patisiran，遞送系統(tǒng)GalNAc藥物Inclisiran為代表，分析臨床前安評(píng)結(jié)果。Patisiran是Alnylam研發(fā)，于2018.8 FDA批準(zhǔn)首 款siRNA藥物。適應(yīng)癥為遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）引起的周圍神經(jīng)疾病，靶點(diǎn)TTR（轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白）。臨床給藥途徑，頻率：靜脈滴注，3周一次, 0.3 mg/kg。遞送載體LNP，通過RNA干擾引起突變型和野生型TTR mRNA的降解，從而導(dǎo)致血清TTR蛋白和組織中TTR蛋白沉積的減少。Patisiran臨床前安評(píng)結(jié)果總結(jié)如下：

       圖6 Patisiran臨床前安評(píng)總結(jié)

       圖7 Patisiran臨床前安評(píng)總結(jié)（續(xù)）

       Inclisiran研發(fā)公司Novartis/Alnylam，于2020.12歐盟首次獲批，全球首 個(gè) siRNA降膽固醇療法藥物，適應(yīng)癥原發(fā)性高膽固醇血癥或混合性血脂異常，靶點(diǎn)PCSK9。臨床給藥途徑、頻率: 皮下注射，第0、3個(gè)月各給藥一次后，維持期6個(gè)月一次，一年只需2次。遞送系統(tǒng)GaINAc，作用機(jī)制Leqvio可與編碼PCSK9蛋白的mRNA結(jié)合，通過RNA的干擾作用來防止肝臟生成PCSK9蛋白。Inclisiran臨床前安評(píng)結(jié)果總結(jié)如下：

       圖8 Inclisiran臨床前安評(píng)總結(jié)

       圖9 Inclisiran臨床前安評(píng)總結(jié)（續(xù)）

       為了探究已上市的5款siRNA非臨床毒性和臨床主要不良反應(yīng)是否有關(guān)聯(lián)性，通過整理支持NDA的NHP 長(zhǎng)毒試驗(yàn)毒性結(jié)果，以及臨床警告和注意事項(xiàng)，非臨床和臨床關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的是肝臟毒性，需要關(guān)注血生化一些指標(biāo)變化，如ALT, AST。

       圖10 Inclisiran臨床前安評(píng)總結(jié)（續(xù)）

       已上市5款siRNA藥物，進(jìn)行了免疫毒性考察，如抗藥抗體、細(xì)胞因子、補(bǔ)體、免疫表型。結(jié)果總結(jié)如下：

       圖11 五款siRNA藥物免疫毒性結(jié)果總結(jié)

       理論上講，若siRNA和靶mRNA準(zhǔn)確地結(jié)合在一起，則可成功的沉默靶基因。然而，許多siRNA都存在siRNA脫靶，并且大多數(shù)siRNA分子可能并不像以前認(rèn)為的那樣具有特異性。siRNA的引入可導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，即抑制目標(biāo)基因靶標(biāo)以外的基因，導(dǎo)致危險(xiǎn)的基因表達(dá)突變和意外后果。根據(jù)日本發(fā)布的《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》，寡核苷酸的毒性分析分為靶向毒性。脫靶毒性。靶向毒性指靶點(diǎn)相關(guān)的藥理學(xué)活性放大所引起的毒性反應(yīng)；脫靶毒性分為雜交依賴、非雜交依賴。雜交依賴脫靶毒性指與靶序列相似的序列雜交而產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)，非雜交依賴脫靶毒性指不依賴于雜交，由分子結(jié)構(gòu)和物理/化學(xué)性質(zhì)所引起的脫靶毒性。雜交和序列相關(guān)因素，應(yīng)在藥物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)被優(yōu)先考慮。靶向毒性的評(píng)估主要依賴于收集有關(guān)靶向的生物功能、組織表達(dá)模式的可用信息，以及來自同一靶向的其他藥物的公開信息。雜交依賴脫靶毒性建議采用生物信息學(xué)的方法、體外考察人源細(xì)胞基因表達(dá)的方法，進(jìn)行評(píng)價(jià)，非雜交依賴脫靶毒性由于來自其物理、化學(xué)性質(zhì)，建議參考化學(xué)藥物非臨床評(píng)價(jià)的一般要求。

       已上市5款siRNA藥物均有肝靶向性，目前LNP組織靶向主要局限于肝臟，IV后80%-90%的LNP會(huì)進(jìn)入肝臟，最終被肝細(xì)胞吸收；GalNAc-siRNA經(jīng)ASGPR介導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞而進(jìn)入靶組織， ASGPR在肝細(xì)胞上大量表達(dá)。組織分布結(jié)果均顯示肝臟濃度最高，如Lumasiran 猴10mg/kg時(shí)，AUC 76700h*μg/mL, 且消除半衰期長(zhǎng)， 高達(dá)409h。用于支持NDA的猴長(zhǎng)毒試驗(yàn)中，組織病理均發(fā)現(xiàn)肝臟變化（無腎臟變化），從輕到重依次是：（1）肝細(xì)胞/枯否細(xì)胞嗜堿性顆粒：可能為供試品或其代謝產(chǎn)物*，可能是細(xì)胞攝取寡核苷酸的適應(yīng)性改變；（2）肝細(xì)胞空泡化：可能為繼發(fā)于胞漿內(nèi)嗜堿性顆粒蓄積的改變；（3）炎癥浸潤(rùn)：高濃度藥物分布時(shí)，會(huì)激活促炎性通路（4）肝細(xì)胞單細(xì)胞壞死：高劑量下嗜堿性顆粒大量蓄積時(shí)可觀察到病理?yè)p傷，如肝細(xì)胞壞死。此外，大部分藥物還伴隨血生化臨檢指標(biāo)變化，如ALT, AST升高。是否是有害變化，要根據(jù)是否對(duì)組織本身?yè)p傷，是否引相關(guān)的指標(biāo)變化，是否可恢復(fù)，其它的siRNA藥物是否有類似改變等綜合判斷。

       除了肝毒性，序列相關(guān)引起的脫靶毒性，還有免疫刺激反應(yīng)，其毒性在很大程度上取決于核苷酸序列設(shè)計(jì)和化學(xué)修飾。siRNA藥物通過激活先天免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致注射部位反應(yīng)(如Patisiran，Inclisiran)、血小板（PLT）減少(如Patisiran, Givosiran)。免疫刺激評(píng)估，可在體外用分離的外周血單核細(xì)胞或全血測(cè)定預(yù)測(cè)細(xì)胞因子釋放來評(píng)估。

       雜交與序列均無關(guān)毒性，如凝血功能改變，siRNA藥物通過抑制凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的因子IXa和輔助因子VIIIa，進(jìn)而選擇性的抑制了部分凝血酶的作用時(shí)間，從而以一種與雜交和序列無關(guān)的方式抑制凝血（如Patisiran，Lumasiran APTT輕微升高）。此外，siRNA藥物還可以結(jié)合抑制性因子H激活補(bǔ)體旁路，補(bǔ)體過度激活可使補(bǔ)體功能改變，引發(fā)繼發(fā)性炎癥和血管炎等（如Patisiran C3a升高，發(fā)現(xiàn)肝臟炎癥浸潤(rùn)、輸注部位血管周圍炎癥）。

       2018年第一款siRNA藥物Onpattro獲批，對(duì)siRNA藥物領(lǐng)域有巨大的振奮作用，是諾貝爾獎(jiǎng)成果從概念走向?qū)嶋H治療用途的一個(gè)光輝里程碑。截止目前已有5款siRNA藥物上市，通過對(duì)五款已上市siRNA藥物臨床前安評(píng)總結(jié)分析，為此類藥物臨床前方案設(shè)計(jì)提供一些參考。相信將來會(huì)有更多的siRNA藥物上市，相關(guān)的臨床前指導(dǎo)原則也會(huì)發(fā)布。

       【參考文獻(xiàn)】

       1. 寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則,日本藥品和醫(yī)療器械管理局（PMDA),2020.03

       2. 王恒,李華,汪溪潔,等. 小核酸藥物非臨床特點(diǎn)和藥理毒理評(píng)價(jià)策略[J]. 中國(guó)新藥雜志,2022,31(12):1137-1145. DOI:10.3969/j.issn.1003-3734.2022.12.001

       3. 余珊珊、胡曉敏、王海學(xué)等. 治療用單鏈寡核苷酸藥物的非臨床研究評(píng)價(jià)概述. 中國(guó)新藥雜志, 2018, 27(10): 1122-1129.

       4. 周宇，王士奇，孫濤, 等. 日本藥品和醫(yī)療器械管理局《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》指南介紹. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2022, 38(22): 2788-2792

       5. Clinical Pharmacology Considerations for the Development of Oligonucleotide Therapeutics Guidance for Industry, FDA, 2022.06

       6. Agrawal, S. & Kandimalla, E. Role of Toll-like receptors in antisense and siRNA [corrected]. Nature biotechnology 22, 1533-1537, (2004).

       7. Henry, S. et al. Activation of the alternative pathway of complement by a phosphorothioate oligonucleotide: potential mechanism of action. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 281, 810-816 (1997).

       8. Sheehan, J. & Phan, T. Phosphorothioate oligonucleotides inhibit the intrinsic tenase complex by an allosteric mechanism. Biochemistry, 40(16), (2001).

       9. Andersson, P. Preclinical Safety Assessment of Therapeutic Oligonucleotides. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2434, 355-370, (2022).

       作者簡(jiǎn)介：磐盛，主要從事臨床前安評(píng)、項(xiàng)目管理等工作，負(fù)責(zé)過的藥物類型有小分子，單抗，雙抗，多肽，ASO, siRNA, mRNA，ADC，疫苗等。通過項(xiàng)目管理，提供一體化新藥研發(fā)和申報(bào)解決方案，讓更多藥物獲批臨床，造福病患。