阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種以記憶缺陷和認(rèn)知功能減退為特征的神經(jīng)退行性疾病，其主要神經(jīng)病理學(xué)特征為神經(jīng)元外β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）聚集成老年斑和細(xì)胞內(nèi)高磷酸化Tau 蛋白積累形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。已上市的常規(guī)藥物只能改善AD 的臨床癥狀，并不能有效延緩病情進(jìn)展。隨著對(duì)AD遺傳學(xué)研究的深入，基因療法成為當(dāng)前最有希望治愈AD的治療方法，其中小干擾 RNA（siRNA）基因療法是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

AD的基因藥物靶點(diǎn)

研究發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，與多個(gè)編碼AD病理性蛋白的基因相關(guān)，如：淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、β-分泌酶-1（beta-secretase1，BACE1）、糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）、載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）和Rho關(guān)聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶2（Rho associated coiled-coil containing protein，ROCKⅡ）等。

①APP

APP是編碼淀粉樣前體蛋白的基因，其多個(gè)位點(diǎn)突變被認(rèn)為是導(dǎo)致AD的重要因素。APP被 β和γ分泌酶順序酶切，會(huì)形成毒性Aβ 聚集體，并在大腦中沉積形成斑塊而損害認(rèn)知活動(dòng)。研究表明于AD患者和AD前患者的神經(jīng)元中引入病毒APP突變（A673T），可減少APP被 β分泌酶裂解，從而減少Aβ 的積累，有助于治療此疾病。

②APOE

APOE是編碼載脂蛋白E的基因，參與脂質(zhì)代謝和運(yùn)輸，主要在大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。研究表明激活A(yù)POE 基因會(huì)刺激APP轉(zhuǎn)錄，而APP被酶切會(huì)產(chǎn)生Aβ聚集體。而且在AD患者腦膠質(zhì)細(xì)胞中APOE4表達(dá)上調(diào)，會(huì)引發(fā)神經(jīng)炎癥，加劇淀粉樣蛋白和Tau病理，損害腦血管。此外 APOE4基因有遺傳風(fēng)險(xiǎn)，易導(dǎo)致晚期遲發(fā)性AD，已有研究表明敲除此基因可顯著改善 AD病理癥狀。

③BACE1

BACE1是編碼β淀粉樣裂解酶的基因，參與促進(jìn)APP運(yùn)輸，與γ分泌酶形成復(fù)合物逐步裂解APP，產(chǎn)生毒性聚集性Aβ，且BACE1 切割是此途徑發(fā)展為散發(fā)性AD的限速步驟。AD患者腦內(nèi) BACE1 蛋白的濃度顯著升高，是AD早期階段的生物標(biāo)志物，也是突觸重塑和可塑性的決定因素。有研究發(fā)現(xiàn)抑制BACE1表達(dá)可阻礙Aβ產(chǎn)生，改善APP轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)變性和行為認(rèn)知障礙，所以BACE1是AD基因治療的首選分子靶點(diǎn)之一。

④GSK3β

GSK3β是編碼糖原合成激酶3β的基因，參與Tau蛋白的過(guò)度磷酸化表達(dá)，累積形成毒性低聚物，促使穩(wěn)定的軸突微管分解，于神經(jīng)元內(nèi)聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。此外GSK3β 還參與APP的代謝調(diào)節(jié)和Aβ 的產(chǎn)生，以及促進(jìn)Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。GSK3β是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的常見(jiàn)靶點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)抑制 GSK3β 的表達(dá)可以改善 AD病理小鼠體內(nèi)p-Tau和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成。

⑤ROCKⅡ

研究表明，編碼蛋白激酶2的ROCKⅡ 基因在大腦中表達(dá)豐富，抑制其表達(dá)有利于神經(jīng)元存活和突觸再生。

siRNA 是最適合于針對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行短期沉默的手段，siRNA能夠與目的基因序列互補(bǔ)并誘導(dǎo)降解相應(yīng)的mRNA，使得mRNA 無(wú)法翻譯成蛋白質(zhì)，從而抑制病理性靶蛋白的產(chǎn)生，顯示出在翻譯水平治療AD的潛力。siRNA發(fā)揮作用的機(jī)制為：雙鏈 siRNA在細(xì)胞中被整合進(jìn)RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），隨后 siRNA的正義鏈被降解，反義鏈指導(dǎo)RISC識(shí)別與其堿基互補(bǔ)的mRNA，并與相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，使得復(fù)合體中的核糖核酸酶Ⅱ剪切靶mRNA，從而調(diào)節(jié)靶基因。siRNA療法不干擾DNA，不會(huì)永久性修改基因組，毒副作用小，靶向能力強(qiáng)，但是siRNA 于體內(nèi)外的穩(wěn)定性、脫靶效應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)外屏障等阻礙著其臨床應(yīng)用，尤其是血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）限制了siRNA 藥物向作用位點(diǎn)的遞送。目前主要通過(guò)基因治療的局部傳遞策略遞送siRNA，如侵入性給藥，但此法有引發(fā)免疫和炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。

siRNA遞送載體的傳遞障礙

siRNA遞送系統(tǒng)在體內(nèi)傳遞過(guò)程中，一般會(huì)遇到3大障礙：體循環(huán)障礙、BBB、溶酶體和內(nèi)涵體屏障。

①體循環(huán)屏障

siRNA的遞送載體在進(jìn)入體循環(huán)后要在血液中保持一定的穩(wěn)定性。但是納米載體作為外源性物質(zhì)，容易被各種血漿蛋白標(biāo)記，經(jīng)過(guò)調(diào)理素作用，容易被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬降解。 納米載體的大小也會(huì)影響其在血液中的傳遞。研究表明，小于10nm的納米顆粒會(huì)被腎臟清除，大于200nm的納米顆粒會(huì)聚集在肝臟、脾臟及骨髓中，一般認(rèn)為小于100nm的納米顆粒適合腦內(nèi)給藥。納米載體表面的Zeta電位小于-10mV時(shí)，容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) （reticuloendothelial system，RES）攝取。Zeta電位大于10 mV時(shí)則容易吸附血漿蛋白，也會(huì)增加在外周細(xì)胞的攝取，除此之外，還會(huì)造成溶血和血小板的聚集現(xiàn)象。接近中性的納米粒，具有更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期，不良反應(yīng)更少。因此，大部分學(xué)者認(rèn)為，納米載體的親水性修飾或者多肽修飾后，可以改善納米載體的表面性質(zhì)，從而減少與血漿蛋白的結(jié)合。因此，納米載體的尺寸、表面電荷及表面修飾等特性，直接影響其體內(nèi)分布及循環(huán)時(shí)間的長(zhǎng)短。

②血腦屏障

BBB的結(jié)構(gòu)與功能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形成了多種生理屏障來(lái)保護(hù)大腦免受病毒、細(xì)菌，以及其他有害物質(zhì)的侵害，這些屏障主要包括了BBB、血?腦脊液屏障、血?視網(wǎng)膜屏障、血?脊髓屏障。BBB位于腦實(shí)質(zhì)和血液循環(huán)之間，由腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基膜、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等組成，是限制98%小分子和近100%大分子藥物進(jìn)入大腦的主要屏障。人類(lèi)大腦在生理狀態(tài)下吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及排出廢物主要依賴(lài)生理轉(zhuǎn)運(yùn)途徑來(lái)完成，包括簡(jiǎn)單擴(kuò)散、跨細(xì)胞親脂途徑、載體介導(dǎo)、外排泵、受體介導(dǎo)、吸附介導(dǎo)和細(xì)胞介導(dǎo)。

依據(jù)生理轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，科學(xué)家們已經(jīng)找到了2種穿過(guò)BBB的方法，及侵入性與非侵入性。 侵入性的方法主要包括腦室內(nèi)灌注、對(duì)流增強(qiáng)遞送、植入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后直接釋放治療藥物的聚合物或微芯片系統(tǒng)、采用物理化學(xué)等方法（聚焦超聲、微波能量、電磁脈沖、甘露醇、阿拉伯膠、緩激肽等）進(jìn)行BBB的瞬時(shí)破壞，但是這些方法可能會(huì)造成BBB的完整性和生理功能永久喪失，導(dǎo)致有害物質(zhì)在大腦中積累，最終對(duì)大腦造成不可逆的損傷。阿拉伯糖、內(nèi)酰胺等滲透促進(jìn)劑的使用可能會(huì)造成腦水腫以及癲癇發(fā)作。保證BBB完整性是安全入腦的必要條件，因此吸附介導(dǎo)、受體介導(dǎo)、載體介導(dǎo)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、抑制外排泵途徑、細(xì)胞介導(dǎo)途徑等非侵入性穿過(guò)BBB是一種相對(duì)安全的方法。此外，非侵入性的方法還包括鼻腦轉(zhuǎn)運(yùn)通路。鼻腔給藥主要是通過(guò)嗅球、三叉神經(jīng)、脈管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)繞過(guò)BBB到達(dá)神經(jīng)中樞，是一種無(wú)創(chuàng)、安全、有前途的治療方法，但這種途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)劑量和轉(zhuǎn)運(yùn)效率都很低。

由于吸附介導(dǎo)的非選擇性，載體介導(dǎo)、細(xì)胞介導(dǎo)、鼻腔給藥的局限性，抑制外排泵的危險(xiǎn)性，受體介導(dǎo)的跨細(xì)胞途徑成為研究者們的首選方法。受體介導(dǎo)地跨BBB方式不僅有很高的選擇性，且該轉(zhuǎn)運(yùn)方式既可以轉(zhuǎn)運(yùn)特定的配體，也能轉(zhuǎn)運(yùn)配體功能化的偶聯(lián)物或者納米粒子，因而成為納米藥物靶向穿過(guò)BBB的最重要方式。

③內(nèi)涵體與溶酶體屏障

siRNA納米遞送載體穿透BBB進(jìn)入細(xì)胞時(shí)形成早期內(nèi)涵體，此時(shí)的pH在6.5～7.5；隨后在內(nèi)涵體中的ATP質(zhì)子泵的作用下，大量的H＋被泵入到早期內(nèi)涵體中，使pH進(jìn)一步降低至5～6.5，促進(jìn)了晚期內(nèi)涵體的形成；晚期內(nèi)涵體進(jìn)一步與溶酶體融合siRNA 浸潤(rùn)在酸性和各種消化酶的環(huán)境中，導(dǎo)致siRNA 降解失活。因此，siRNA必須快速地從內(nèi)涵體或溶酶體中逃逸出去，才能使siRNA保持活性。但不幸的是，大部分被細(xì)胞攝取的siRNA 納米載體都被困在晚期內(nèi)涵體和溶酶體中，只有1%～3%的siRNA 成功完成內(nèi)涵體和溶酶體的逃逸。目前逃逸內(nèi)涵體和溶酶體的機(jī)制主要有質(zhì)子海綿效應(yīng)、降低膜的穩(wěn)定性（膜融合、孔洞形成）、光化學(xué)內(nèi)化。其中質(zhì)子海綿效應(yīng)已經(jīng)成為siRNA 逃逸內(nèi)涵體的主要途徑。因此，一個(gè)優(yōu)良的siRNA 納米載體是實(shí)現(xiàn)高效腦部遞送，并在靶細(xì)胞快速釋放的關(guān)鍵。

參考資料

[1]張瑤瑤,蘇峰,曹俊如,等.阿爾茨海默病的小干擾RNA療法藥物遞送研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2024,33(15):1571-1579.

[2]蘇峰,熊峰,曹俊如,等.基于穿透血腦屏障的siRNA納米遞藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2024,59(04):285-295.

作者簡(jiǎn)介：小米蟲(chóng)，藥品質(zhì)量研究工作者，長(zhǎng)期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗(yàn)證工作，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗(yàn)分析及分析方法驗(yàn)證。