大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，屬于安全的重組菌類，因?yàn)槠浞肿舆z傳學(xué)背景清楚，代謝可塑性強(qiáng)，異源蛋白表達(dá)效率高，且繁殖迅速、培養(yǎng)工藝簡(jiǎn)單成熟，容易實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)是科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)的常用重組菌之一。大腸桿菌宿主菌應(yīng)用較成熟的有：BL21系列、JM109系列、W3110系列和K802系列等，常用的啟動(dòng)子有Ptrp、Ppho、PL、PR、Plac等，質(zhì)粒如pET、pBV220、pRK1、pRLK14等(1)。
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影響重組大腸桿菌穩(wěn)定性的因素有重組策略，重組元件即宿主菌、載體質(zhì)粒與外源基因。是在現(xiàn)有途徑中做代謝流修改還是直接另起爐灶開(kāi)辟新的代謝流，是重組策略；是將外源基因直接插入染色體還是采用載體質(zhì)粒攜帶，是重組策略；是采用單一大質(zhì)粒一次轉(zhuǎn)入還是采用兩個(gè)獨(dú)立的小質(zhì)粒分步轉(zhuǎn)入，甚至基因間的不同排序與組合，也是重組策略；如何誘導(dǎo)表達(dá)也是重組策略。選用哪個(gè)已知的外源基因序列，選用哪個(gè)載體質(zhì)粒，選用哪個(gè)宿主菌，是重組元件的選擇。一般選用稀有密碼子較少的，GC含量稍低的，表達(dá)的蛋白酶專一性合適的外源基因序列；一般選用具有合適拷貝數(shù)，合適啟動(dòng)子與終止子的載體質(zhì)粒；一般選用適合酶的內(nèi)外分泌，利于酶與起始物及中間體接觸的，重組蛋白不易受大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶降解的底盤(pán)作為宿主菌。重組策略與重組元件選擇都屬于分子級(jí)內(nèi)容，這是重組大腸桿菌的根本。不同的重組結(jié)果得到表達(dá)的酶的活力、穩(wěn)定性完全不同，這也就造就了重組菌不同的代謝效率與代謝穩(wěn)定性。
影響重組大腸桿菌穩(wěn)定性的因素還有發(fā)酵策略，發(fā)酵方式與培養(yǎng)控制條件。在發(fā)酵產(chǎn)物為小分子油性物質(zhì)時(shí)，使用不能代謝的油性類似物作為萃取劑，加入發(fā)酵體系中萃取細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，降低重組菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物積累，促使產(chǎn)物持續(xù)高強(qiáng)度合成屬于發(fā)酵策略；指數(shù)生長(zhǎng)期前后采用誘導(dǎo)劑啟動(dòng)誘導(dǎo)，或者是在產(chǎn)物積累后期采用升溫轉(zhuǎn)化，也屬于發(fā)酵策略。是采用滲透提取的連續(xù)發(fā)酵還是采用分批（補(bǔ)料）發(fā)酵，是發(fā)酵方式的選擇。發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中的溫度、pH、殘?zhí)牵胺N子量、基礎(chǔ)培養(yǎng)基與補(bǔ)料控制屬于培養(yǎng)控制條件范疇。一般溫度過(guò)高，比生長(zhǎng)速率較高，外源基因片段易變異，外源質(zhì)粒異丟失，而溫度過(guò)低呢，又影響前體的產(chǎn)生與體系整體能量的供給；一般低pH控制體系的乙酸濃度與銨離子濃度都相對(duì)較低，利于異源酶的表達(dá)與代謝活性，而pH過(guò)低呢又不利于多數(shù)酶促反應(yīng)；一般地在發(fā)酵早期，低葡萄糖濃度條件下，乙酸可以再被利用，但過(guò)低的碳氮比又會(huì)影響代謝流，且更不利于帶質(zhì)粒重組菌的生長(zhǎng)。種子量、基礎(chǔ)培養(yǎng)基與補(bǔ)料等，通過(guò)培養(yǎng)過(guò)程中的比生長(zhǎng)速率不同而影響重組大腸桿菌的穩(wěn)定性，都需控制在合適范圍內(nèi)。
發(fā)酵時(shí)控制重組大腸桿菌不穩(wěn)定性，重要的是對(duì)重組菌的一些選擇策略。如首選將外源基因直接整合到宿主的染色體上，從根本上消除質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重組菌進(jìn)行放大；如選用在質(zhì)粒載體中引入質(zhì)粒丟失細(xì)胞的條件致死基因，可有效殺死質(zhì)粒丟失的空載細(xì)胞的重組菌；選用在外源基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建過(guò)程中引入可控的復(fù)制子和啟動(dòng)子，以減少減少由于重組分子大量擴(kuò)增及目的產(chǎn)物過(guò)量表達(dá)對(duì)受體細(xì)胞正常代謝的干擾的重組菌等。
提高重組大腸桿菌的發(fā)酵水平，需要首先考慮并控制重組大腸桿菌的穩(wěn)定性，在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)控制誘導(dǎo)水平和細(xì)胞比生長(zhǎng)速率而提升重組菌的穩(wěn)定性。再通過(guò)提高重組菌生長(zhǎng)OD和提高單位菌體生產(chǎn)強(qiáng)度來(lái)提高大腸桿菌的發(fā)酵水平(2)，這也是合成生物學(xué)菌株改造后篩菌選菌的表觀指標(biāo)。即在選菌之初就選擇OD生長(zhǎng)較高的、單位菌體生產(chǎn)強(qiáng)度較大、穩(wěn)定性較好的重組菌株。再改善影響條件和優(yōu)化發(fā)酵工藝后提高重組大腸桿菌的發(fā)酵產(chǎn)出。
參考文獻(xiàn)：
1. <重組大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)及代謝調(diào)控研究進(jìn)展.pdf>.
2. <基因工程重組大腸桿菌發(fā)酵生物量產(chǎn)出的影響因素評(píng)估.pdf>.
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