高效液相色譜法（HPLC）是制藥行業(yè)分析檢測的主要手段，也是分析工作者首當(dāng)其沖需要掌握的一門技術(shù)。隨著2025藥典的發(fā)布與實施，液相檢測技術(shù)也迎來了新的挑戰(zhàn)。
2025年版《中國藥典》二部對110多個品種標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)檢查項進行了增加或修訂。以青霉胺為例，2020年版藥典標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC-UV法，僅能控制青霉胺二硫化物,未控制其他有關(guān)物質(zhì),美國藥典與歐洲藥典也僅能控制青霉胺二硫化物。2025藥典采用HPLC- ELSD法，提高了方法的靈敏度和雜質(zhì)檢測能力,對青霉胺二硫化物和其他雜質(zhì)均實現(xiàn)了有效控制【1】。
隨著藥典標(biāo)準(zhǔn)的不斷升級和優(yōu)化，某些品種采用傳統(tǒng)的HPLC-UV檢測法，已無法滿足質(zhì)量控制的需求，從而逐漸被新的檢測器所替代。
檢測器作為觀測化合物出峰的"眼睛"，在高效液相色譜法中承擔(dān)著舉足輕重的地位，選錯檢測器勢必導(dǎo)致有眼如盲。
本文介紹了高效液相色譜法中常見檢測器的特點和使用考慮要點，旨在分享經(jīng)驗所得。
HPLC中常見的檢測器種類及其原理
HPLC中使用最為普遍的是UV檢測器，其原理是基于化合物吸收特定波長的UV光產(chǎn)生響應(yīng)。然而，并非所有的化合物均有紫外吸收，某些化合物即使在低波長下，紫外響應(yīng)也可能較弱，無法滿足分析方法靈敏度的要求。故而，在正式進行分析方法開發(fā)前，應(yīng)對待測化合物的結(jié)構(gòu)進行分析，初步評估常規(guī)的UV檢測器是否能滿足基本檢測需求，即"是否有響應(yīng)"。
通常含有共軛體系的化合物在紫外光區(qū)均有吸收，如不飽和脂肪酸、醛、酮、以及芳香化合物等。幾乎所有的芳香族化合物在 260nm下都有非常強烈的吸收，擁有一個或者更多雙鍵的化合物可以在波長小于215nm 時被檢測到【2】。至于"是否能靈敏檢出"，除了化合物本身的紫外吸收屬性，還取決于方法選擇的波長、供試品的濃度、進樣體積以及對靈敏度要求的高低，方法靈敏度最終需要實際的數(shù)據(jù)支持。
對于有紫外吸收但是經(jīng)過UV光的輻射激發(fā)能產(chǎn)生熒光的化合物，可以選擇熒光檢測器（FLD）來獲得更高的靈敏度，從而用于痕量測定。如α-三聯(lián)噻吩，使用熒光檢測器獲取的檢出限為0.5 ng/mL，使用二極管陣列檢測器獲取的檢出限為100 ng/mL，兩種檢測器的靈敏度相差了200倍【3】。
對于沒有紫外吸收的化合物，可以選擇通用檢測器，分析實驗室最常見的就是示差檢測器（RID）和蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）。近年來，電霧式檢測器（CAD）作為ELSD或RID的替代檢測器，由于其出色的靈敏度和重復(fù)性，逐漸嶄露頭角。
RID的原理是利用被檢測分子的折光系數(shù)與流動相的差異，差異越大，檢測的靈敏度越高。然而，RID的靈敏度相比其他檢測器而言，最佳情況下也只能算個中等水平，故而不適用于痕量測定。藥品檢驗中，通常用于一些糖類、醇類的含量測定或者聚合物分子量的測定，如HPLC-RID法測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及乳糖含量【4】、HPLC-RID法測定磷酸奧司他韋干混懸劑中山梨醇的含量【5】、高效凝膠色譜法測定多花黃精多糖分子量與分子量分布【6】。
同樣作為通用檢測器，ELSD的靈敏度一般情況下比RID要高出10~100倍【2】。ELSD的原理是在流動相蒸發(fā)的基礎(chǔ)上，測量非揮發(fā)性溶質(zhì)顆粒造成的光散射，因此測量靈敏度會隨著待測分析物的揮發(fā)性增加而減弱。ELSD通常用于檢測磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等化合物，比如HPLC-ELSD檢測南極磷蝦油中磷脂含量【7】。另外，ELSD也可用于無機離子的含量測定【8】。
CAD基于霧化的原理，洗脫液霧化后形成顆粒，經(jīng)過蒸發(fā)管干燥后與帶電氮氣碰撞，使得分析物顆粒表面帶正電荷，分析物顆粒的質(zhì)量與表面所帶電荷量相關(guān)。由于CAD的通用性強及定量范圍寬等優(yōu)勢，其在皂苷類、生物堿類、類黃酮及有機酸類等天然產(chǎn)物的質(zhì)量分析中具有廣泛的應(yīng)用【9】。
MS檢測器在研發(fā)領(lǐng)域使用也很廣泛，其原理是利用電磁學(xué)原理，將待測樣品分子解離成具有不同質(zhì)量的離子，然后按其質(zhì)荷比(m/z)的大小依次排列收集成質(zhì)譜，可用來提供分析物的相對分子量和結(jié)構(gòu)信息，常用于化合物的結(jié)構(gòu)確證。但MS檢測器成本較高、對實驗人員的專業(yè)技能要求也高。
不同檢測器使用時的考慮要點：
考慮要點1-流動相：
UV檢測器要求使用的流動相無吸收，或在被測組分吸收波長處無吸收，因此方法選擇的波長應(yīng)大于流動相的截止波長。RID要求流動相和待測化合物折射率有差異，差異越大，靈敏度越高。ELSD、CAD、MS均要求流動相具有揮發(fā)性，而且不含有非揮發(fā)性的添加劑(比如磷酸鹽)。對于UV檢測器，由于流動相中可使用非揮發(fā)性緩沖鹽，使用時應(yīng)注意緩沖鹽濃度與有機溶劑比例，防止鹽析。
下圖【2】分別提供了一些常見的緩沖液和溶劑的相關(guān)參數(shù)，為流動相選擇提供參考。
考慮要點2-洗脫方式：
RID一般不適用于梯度洗脫，因為在梯度情況下匹配參比池和樣品池的折射率是極其困難的（RID包含參比池和樣品池，使用前用流動相沖洗參比池，以流動相為背景做參比，假設(shè)采用梯度洗脫方式，實際的背景一直在變，可參比池卻不能緊跟其變，故而影響響應(yīng)）。
RID用于等度洗脫時也不如UV省心， 流動相未脫氣、中途更換流動相、流動相揮發(fā)等都更容易造成RI基線漂移，故而在實際實驗過程中，應(yīng)盡可能地一次性配制足夠多的流動相，并且充分脫氣，避免實驗中途添加流動相或者更換流動相瓶，若流動相中含有揮發(fā)性溶劑，應(yīng)用封口膜纏繞瓶口，防止流動相揮發(fā)。最后值得關(guān)注的一點是，盡可能地采用單元泵。
其他幾款檢測器，如UV檢測器、MS、CAD、ELSD、FLD，均可用于梯度洗脫。
實際使用時，UV檢測器若采用梯度洗脫方式，應(yīng)盡量避免采用UV吸光度差異較大的兩相作為流動相，比如四氫呋喃和水，若必須使用，可考慮在水相中混入一定比例的有機相，降低兩相間差異；另外一個方式是選擇更高一點的波長（這個措施往往不是很實際，除非待測化合物在高波長處有較好的吸收）。
考慮要點3-溫度：
UV檢測器、MS、CAD、ELSD、FLD受溫度的影響均較小，但RID對溫度變化敏感，主要體現(xiàn)在：對環(huán)境溫度敏感、對柱溫和檢測器溫度差異敏感。因此，實際使用之前建議至少提前半小時預(yù)熱機器，夏天要及時開啟空調(diào)保持環(huán)境溫度可控，方法設(shè)置時應(yīng)避免柱溫和檢測器溫度差異過大。
筆者感悟：
每種檢測器都有它的優(yōu)點和使用限制，合理運用、揚長避短，才能發(fā)揮他們的核心價值。
參考文獻：
【1】 2025年版《中國藥典》二部主要增修訂內(nèi)容解讀
【2】 現(xiàn)代液相色譜導(dǎo)論
【3】 高效液相色譜-熒光檢測法測定化妝品中α-三聯(lián)噻吩
【4】 HPLC-RID法測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及乳糖含量
【5】 HPLC-RID法測定磷酸奧司他韋干混懸劑中山梨醇的含量
【6】 高效凝膠色譜法測定多花黃精多糖分子量與分子量分布
【7】 HPLC-ELSD檢測南極磷蝦油中磷脂含量
【8】 親水作用色譜-蒸發(fā)光散射法測定甲基纖維素中氯離子
【9】 電噴霧檢測器的工作特點及其在藥物分析中的應(yīng)用進展
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