外膜囊泡(Outer membrane vesicles, OMVs)是由革蘭氏陰性菌分泌的雙層脂質(zhì)納米囊泡。OMVs 含有細(xì)菌衍生的多種成分，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和其他小分子，還包括抗原病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，這是疫苗的基本成分，基于此，天然 OMVs 或生物工程 OMVs 被開發(fā)為細(xì)菌疫苗，以對其親本細(xì)菌產(chǎn)生強大的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。OMVs含有的多種生物分子，是細(xì)菌與細(xì)菌、環(huán)境和宿主等交流的重要介質(zhì)，因此它們可能成為抗腫瘤的有效的方案。

OMVs 的結(jié)構(gòu)成分

OMVs含有細(xì)菌多種衍生成分，主要包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸及其他小分子。OMVs 膜主要含有磷脂(Phospholipid, PL)和脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)，PL主要包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油等，不同革蘭氏陰性菌的OMVs 的磷脂含量有所不同。在大腸桿菌中，OMVs主要脂質(zhì)為甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine, PE)和心磷脂；銅綠假單胞菌膜OMVs的主要成分為磷脂酰甘油；腦膜炎奈瑟菌的OMVs主要含有磷脂酰甘油和PE。LPS 是一種重要的PAMPs，在生物膜中發(fā)揮粘附功能，也是 OMVs 的主要組成部分。

在OMVs中鑒定出的蛋白質(zhì)可以分為三類：外膜的基本成分，腔內(nèi)特定的貨物蛋白，以及未知或污染的蛋白質(zhì)。第一類屬于外膜蛋白，如孔蛋白、較大運輸系統(tǒng)的外膜蛋白部分、 錨定蛋白黏附蛋白、酶（如磷脂酶和蛋白酶），以及鞭毛或菌毛蛋白、補體調(diào)節(jié)蛋白、結(jié)合蛋白、不濁相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)運體、離子通道蛋白等。第二類包括周質(zhì)酶、細(xì)胞質(zhì)酶以及一些毒力因子，如蛋白酶、肽酶、核酸酶、溶細(xì)胞素、霍亂毒素、空泡細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒性膨脹毒素和脲酶等酶。最后一類蛋白質(zhì)是常見的細(xì)胞質(zhì)蛋白包括延伸因子、伴侶蛋白和熱休克蛋白。 在OMVs 中也發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，這些蛋白被認(rèn)為是來自培養(yǎng)物中裂解細(xì)胞的污染物。OMVs同時攜帶腔內(nèi)和表面相關(guān)的DNA，此外RNA、質(zhì)粒、噬菌體DNA和染色體 DNA在 OMVs中也有報道。研究認(rèn)為核酸被OMVs 攜帶可能來自于環(huán)境中細(xì)胞的裂解殘留物。此外，OMVs 還可以運輸多種離子、群體感應(yīng)信號和代謝物。

OMVs應(yīng)用于腫瘤治療

在抗腫瘤研究中，OMVs既能作為載體用于抗腫瘤藥物的遞送，也能作為免疫調(diào)節(jié)劑重塑腫瘤免疫微環(huán)境、激活機(jī)體自身免疫反應(yīng)以協(xié)同化療/PDT等療法抑制腫瘤生長；在腫瘤疫苗領(lǐng)域，OMVs可同時作為疫苗納米載體和佐劑以激起強效的腫瘤特異性免疫反應(yīng)，而且OMVs自身也能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡、調(diào)節(jié)免疫等手段起到一定抑制腫瘤生長的作用。

1、OMVs的載體優(yōu)勢

易于修飾的特點及自身性質(zhì)使OMVs被廣泛作為抗腫瘤藥物遞送載體研究。首先，尺寸效應(yīng)使OMVs本身就具有一定腫瘤靶向能力；其次，靶向修飾可進(jìn)一步的增加OMVs對特定細(xì)胞的靶向性；最后，表面PAMPs分子與納米級的粒徑使得OMVs兼具佐劑性與淋巴滯留能力，這可以極大地協(xié)同抗原增強抗腫瘤免疫反應(yīng)與表面修飾。

對OMVs進(jìn)行藥物裝載可分為分泌前裝載與分泌后裝載兩類方法。分泌前加載是對細(xì)菌進(jìn)行處理以得到封裝有藥物的OMVs，這種方法主要用于易變性的生物分子。例如，研究人員在細(xì)菌培養(yǎng)過程加入慶大霉素，利用細(xì)菌會通過OMVs排出有害物質(zhì)的性質(zhì)，得到了封裝有慶大霉素的OMVs，而利用基因工程則可使OMVs高效加載蛋白質(zhì)類藥物。分泌后加載是將藥物封裝人已分離提純的OMVs中，脂雙層結(jié)構(gòu)使OMVs既可封裝疏水藥物又可封裝親水藥物。通過與藥物共孵育，疏水性小分子藥物可封裝在OMVs膜內(nèi)，同時帶正電的小分子藥物可利用靜電吸附作用封裝在OMVs膜上；而通過電穿孔、超聲處理、物理擠出或滲透處理等方法可使OMVs封裝親水性藥物分子。

作為載體，OMVs可靶向腫瘤部位：OMVs表面富集的PAMPs使其易被血液循環(huán)中的中性粒細(xì)胞吞噬，而由于中性粒細(xì)胞具有炎性靶向能力，因此OMVs可利用中性粒細(xì)胞靶向炎性腫瘤組織。OMVs到達(dá)炎性腫瘤后，可通過中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）形成過程中被釋放出來且不影響活性，這使得OMVs具有天然的腫瘤靶向能力。同時，20~250nm的粒徑使OMVs可以自由循環(huán)至淋巴結(jié)，表面富集的PAMPs使其易于被DC攝取滯留淋巴，并誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)。研究表明隨插隨顯示的OMVs抗原展示平臺在小鼠體內(nèi)有明顯的淋巴蓄積現(xiàn)象，激活了有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，OMVs可以通過毛囊途徑和表皮滲透兩種途徑穿過角質(zhì)層到達(dá)真皮層，這賦予了其作為透皮藥物遞送載體獨特的優(yōu)勢。

2、OMVs對腫瘤的直接殺傷

在抗腫瘤研究中，OMVs自身就對腫瘤具有一定的殺傷效果。PAMPs的富集使OMVs可通過受體激活的死亡途徑在細(xì)胞層面可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡或調(diào)亡。首先，有研究表明，OMVs通過內(nèi)吞途徑進(jìn)人宿主細(xì)胞后可在早期內(nèi)體階段將LPS釋放到胞質(zhì)中，繼而在GBPs的幫助下激活Caspase-11，引起細(xì)胞焦亡并釋放炎性因子IL-1β，修飾后的LPS則不具有激活Caspase-11的能力。其次，細(xì)菌OMVs可誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位降低，引發(fā)線粒體功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體調(diào)亡、炎癥小體激活，最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡。最后，致病菌OMVs可遞送毒力因子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，例如：致病型大腸桿菌OMVs上攜帶的細(xì)胞質(zhì)酶HlyF可通過阻斷細(xì)胞自噬體與溶酶體的融合阻斷自噬，激活非經(jīng)典炎癥小體途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。不過，細(xì)胞可通過多種途徑抑制由OMVs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此，OMVs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡受多種因素影響，包括OMVs的組分構(gòu)成、PAMPs分子的相對濃度以及宿主細(xì)胞敏感度等。

OMVs在活體層面也有一定的腫瘤抑制效果，這主要歸功于OMVs對機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活。首先，OMVs可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM） 向促炎M1型巨噬細(xì)胞極化；其次，OMVs可招募包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞，這既能逆轉(zhuǎn)腫瘤區(qū)域免疫抑制性的微環(huán)境，也能在腫瘤區(qū)域誘導(dǎo)干擾素（IFN-γ）的產(chǎn)生以介導(dǎo)腫瘤凋亡。然而，IFN-γ在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的同時會上調(diào)腫瘤細(xì)胞程序性死亡配體1（programmedcelldeath1 ligand1，PD-L1）的表達(dá)，這抑制了T細(xì)胞活性并最終降低了抗腫瘤效果。針對這個問題，研究人員通過基因工程化修飾得到了程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1，PD-1）修飾的OMVs，在保留OMVs腫瘤殺傷能力的同時通過對腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的封閉解除了腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞的功能抑制，顯著提高了腫瘤抑制效果。類似的，通過基因工程得到的表面表達(dá)CD47抗體的OMVs不僅能封閉腫瘤表面CD47分子以解除其對巨噬細(xì)胞的吞噬抑制，還能作為橋梁連接巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以增強吞噬，該工程化的OMVCD47nb在小鼠體內(nèi)重塑了腫瘤微環(huán)境且激活了腫瘤特異性免疫反應(yīng)，在有效抑制腫瘤生長的同時誘導(dǎo)了對腫瘤的長期免疫記憶。

3、OMVs激活免疫協(xié)助增強抗腫瘤效果

OMVs對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用使其在抗腫瘤研究中大有可為。首先，OMVs對免疫細(xì)胞的強烈刺激可對免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境進(jìn)行重編程，這可增強化療、光動力等對腫瘤的抑制效果。其次，OMVs的佐劑性及淋巴靶向性使其在腫瘤疫苗的應(yīng)用中有著廣泛應(yīng)用前景。因此，OMVs主要作為遞送載體、免疫調(diào)節(jié)劑、佐劑等應(yīng)用于臨床前抗腫瘤研究。

在腫瘤治療中，OMVs不僅可作為納米遞送載體增加抗腫瘤藥物的利用率并降低藥物副作用，還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑激活機(jī)體免疫反應(yīng)以協(xié)同增強化療、PDT等抗腫瘤療法的療效。早在2014年，研究人員利用基因工程化的接有腫瘤靶向肽的減毒OMVs向腫瘤部位遞送了小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），有效抑制了腫瘤生長。此后，OMVs被廣泛用于抗腫瘤藥物的遞送。例如，載有光敏劑二氫卟吩e6（chlorine6，Ce6）和化療藥阿霉素（doxorubicin，DOX）的OMVs作為治療平臺，通過光動力、化療與免疫療法的有機(jī)協(xié)同實現(xiàn)了對小鼠三陰性乳腺腫瘤的完全抑制，并成功防止了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。負(fù)載黑色素的OMVs有著良好的光熱轉(zhuǎn)換效率，其不僅可在近紅外激光的照射下對腫瘤進(jìn)行局部加熱以殺死腫瘤，還可利用多光譜光聲斷層掃描技術(shù)（multispectral optoacoustic tomography，MSOT） 對腫瘤組織進(jìn)行光聲成像。

在腫瘤疫苗研究中，OMVs同時作為疫苗納米載體與免疫佐劑來增強由針對腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)。作為載體，工程化的OMVs既可以快速捕獲多種腫瘤抗原，又可以靶向淋巴結(jié)并增強DC對抗原的攝取，同時OMVs能作為佐劑進(jìn)一步增強腫瘤特異性免疫反應(yīng)，強效的免疫反應(yīng)消除了小鼠皮下腫瘤并抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。類似的，利用OMVs向DC遞送抗原mRNA能引起有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，成功實現(xiàn)了對腫瘤的抑制并誘導(dǎo)了長期免疫記憶的產(chǎn)生。然而由佐劑誘導(dǎo)的DC快速成熟會導(dǎo)致其攝取能力降低，這種現(xiàn)象被稱為成熟誘導(dǎo)的攝取阻塞(maturation-induced uptake obstruction，MUO）。對此，研究人員通過在OMVs修飾上葡萄球菌蛋白A的結(jié)構(gòu)域B（domain Bof staphylococcal protein A）以結(jié)合αDEC205抗體的Fc端，而αDEC205抗體的Fab端與DC表面DEC205（CD205，一種具有抗原呈遞功能的內(nèi)吞受體）的結(jié)合使OMV-DEC能通過異位攝取途徑突破MUO的限制。因此，DC對OMV-DEC表現(xiàn)出比OMVs更強的攝取能力，這增強了OMV-DEC對抗原的呈遞能力，激活了更強的抗腫瘤免疫反應(yīng)，成功抑制了黑色素瘤的生長與轉(zhuǎn)移。

作為細(xì)菌分泌物，OMVs可由腸道細(xì)菌原位產(chǎn)生，因此，研究人員開發(fā)了一種阿拉伯糖誘導(dǎo)型基因工程化大腸桿菌作為口服型腫瘤疫苗。大腸桿菌在小鼠腸道原位產(chǎn)生負(fù)載腫瘤抗原的OMVs，其可穿過腸上皮細(xì)胞屏障，刺激DC成熟，并進(jìn)一步激活腫瘤特異性免疫反應(yīng)以殺傷腫瘤細(xì)胞。在小鼠模型中，該疫苗不僅實現(xiàn)了對腫瘤的抑制，原位產(chǎn)生的方式還使其避免了分離提純的繁瑣步驟，有效降低了生產(chǎn)成本。而為了實現(xiàn)個性化治療，可將OMVs與腫瘤細(xì)胞膜或腫瘤外泌體融合，得到的雜化囊泡作為個性化腫瘤疫苗能誘導(dǎo)強烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，提高小鼠生存率并提供對腫瘤的長期防護(hù)。進(jìn)一步的，OMV-Mal可在腫瘤原位捕獲PTT后釋放的腫瘤抗原，并將之遞送至DC以引發(fā)腫瘤特異性免疫反應(yīng)。這種策略不僅通過增強抗原攝取、刺激DC成熟等手段增強了免疫反應(yīng)，還實現(xiàn)了免疫療法與PDT、PTT、化療等治療方法的協(xié)同。

OMVs在腫瘤領(lǐng)域中具有多重功能。它們不僅促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，還調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤的發(fā)展。OMVs 中攜帶的生物標(biāo)志物還可以作為腫瘤的診斷標(biāo)志，有助于腫瘤的早期監(jiān)測。此外，OMVs作為藥物載體，可有效傳遞抗腫瘤藥物到腫瘤部位，提高治療效果，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考資料

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[2]王云鋒,莊婉茹,馬憲彬,等.細(xì)菌外膜囊泡應(yīng)用于腫瘤治療[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2024,51(02):309-327.

作者簡介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。