人類諾如病毒（Human norovirus，HuNoV），也被稱為諾瓦克病毒，是全球急性胃腸炎的主要原因之一。HuNoV影響所有年齡組，具有高度傳染性，特別是免疫系統(tǒng)較弱的人群，并可能導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床后果。由于 HuNoV 具有遺傳變異大、進(jìn)化快的特點(diǎn)，這給抗病毒藥物的研發(fā)造成了極大挑戰(zhàn)。在全球范圍內(nèi)，大多數(shù)胃腸炎病例是由大流行性 GII.4 人類諾如病毒（HuNoV）毒株引起的。據(jù)估計(jì)，諾如病毒每年導(dǎo)致約 6.84 億人患病，約 21.2 萬(wàn)人死亡。衛(wèi)生系統(tǒng)和社會(huì)直接成本每年超過(guò)600 億美元。作為一種傳染性極強(qiáng)的腸道病原體，其對(duì)全球公共衛(wèi)生造成重大威脅，引起了國(guó)際上的廣泛關(guān)注。目前，還沒(méi)有批準(zhǔn)的疫苗和針對(duì) HuNoV 的特異性治療方法。

       諾如病毒（Norovirus，NoV）是無(wú)包膜的單股正鏈 RNA 病毒。HuNoV的RNA 基因組長(zhǎng)約 7.7 kb，其基因組由三個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）組成：ORF1 編碼一個(gè)多聚蛋白，該蛋白被病毒蛋白酶裂解為六個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，其中包括 RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RdRp），這是一種促進(jìn)病毒 RNA 復(fù)制的關(guān)鍵酶；ORF2 編碼主要衣殼蛋白 VP1，該蛋白結(jié)構(gòu)上分為S和 P區(qū)兩個(gè)相鄰的區(qū)域，其中 S區(qū)形成內(nèi)核，構(gòu)成 VP1 的底座；P 區(qū)形成拱樣結(jié)構(gòu)突出于內(nèi)核外，可進(jìn)一步分為 P1和P2亞結(jié)構(gòu)域；ORF3 編碼次要衣殼蛋白VP2，VP2具有穩(wěn)定病毒顆粒的作用。根據(jù)VP1 的氨基酸序列，NoV 被分類為至少10個(gè)基因組（GI-GX），這些基因組進(jìn)一步細(xì)分為49個(gè)基因型。在可感染人類的五種基因組（GI、GII、GIV、GVIII和GIX）中，GI 和GII 突變體是導(dǎo)致腸胃炎病例的主要病原體。特別是 GII.4 基因型長(zhǎng)期以來(lái)一直是全球胃腸炎暴發(fā)的主要原因，其變體每隔 2-4 年就會(huì)進(jìn)化成新的變體，因其高傳染性和引發(fā)大規(guī)模流行病的能力而聞名。

       NoV基因組測(cè)序有助于開(kāi)發(fā)基于核酸的NoV 檢測(cè)方法。20世紀(jì)90年代中期，第一個(gè)以 ORF1 中RNA 聚合酶基因相對(duì)保守區(qū)為靶點(diǎn)的 RT-PCR 被用于檢測(cè) NoV。此后，針對(duì) NoV開(kāi)發(fā)了更多實(shí)時(shí)、快速和靈敏的分子檢測(cè)方法，包括 RT-qPCR、微滴數(shù)字 RT-PCR、多重 RT-PCR、巢式 PCR、高通量測(cè)序基因芯片、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法等。通過(guò)靶向檢測(cè)ORF1-ORF2 連接處的保守基因組區(qū)域，發(fā)現(xiàn)基于實(shí)時(shí)核酸的方法比抗原檢測(cè)分析更靈敏、更具廣泛的反應(yīng)性。普通 RT-PCR 在電泳過(guò)程中易交叉污染。多重 RT-PCR 雖然具有同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)分子的優(yōu)點(diǎn)，但容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增。巢式 PCR 無(wú)法對(duì)病毒定量，耗時(shí)長(zhǎng)且容易發(fā)生交叉污染。近年來(lái)，普通 RT-PCR、多重 RT-PCR 等逐步被新方法取代。

       諾如病毒小分子抑制劑

       人類諾如病毒抗病毒藥物早期研究的進(jìn)展緩慢，很大程度上是由于其細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立困難。直到2016 年，人類諾如病毒在源自干細(xì)胞的人腸上皮細(xì)胞（human intestinal enteroids, HIEs）中的培養(yǎng)系統(tǒng)才初步建立，但 HIEs 系統(tǒng)中的病毒復(fù)制量?jī)H為670倍，其有限的病毒復(fù)制量仍是研究疫苗和藥物的障礙（諾如病毒在B細(xì)胞系中的復(fù)制量更低）。此外，人類諾如病毒具有物種特異性，無(wú)法感染其他物種。此前對(duì)人類諾如病毒的認(rèn)知主要基于其他杯狀病毒研究，例如通過(guò)鼠諾如病毒在細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠模型中篩選潛在抗病毒藥物。在腸道類器官培養(yǎng)模型中篩選諾如病毒抑制劑成為開(kāi)發(fā)慢性感染治療的新策略，許多廣譜抗病毒藥物已在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)諾如病毒的抑制活性。

       1、RNA 聚合酶抑制劑

       HuNoV的RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，成為抗病毒治療的重要靶點(diǎn)。RdRp是一種用于病毒復(fù)制的酶，在RNA 病毒中高度保守，且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無(wú)同源蛋白，是抗病毒藥物研究的重要靶點(diǎn)。HuNoV 的RdRp 結(jié)構(gòu)類似于其他正鏈 RNA 病毒，具有右手型結(jié)構(gòu)，包括手指、手掌和拇指子結(jié)構(gòu)域，以及連接手指和拇指的 N端結(jié)構(gòu)域。手指和拇指子結(jié)構(gòu)域協(xié)作包圍手狀結(jié)構(gòu)，形成單鏈模板 RNA 的通道。

       ①核苷類抑制劑

       RNA依賴性RNA 聚合酶（RdRp）是治療諾如病毒感染的重要靶點(diǎn)。核苷類抑制劑（nucleoside inhibitors, NIs）作為底物類似物，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制終止 RNA 合成，通常表現(xiàn)出廣譜抗病毒活性。目前發(fā)現(xiàn)，針對(duì)其他 RNA 病毒開(kāi)發(fā)的核苷抑制劑也可用于諾如病毒感染治療。

       法匹拉韋（favipiravir, T-705）是一種前藥，在體內(nèi)快速轉(zhuǎn)化為法匹拉韋三磷酸，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄并誘發(fā)致命突變。該藥物已在部分國(guó)家廣泛用于流感治療，并在埃博拉病毒、COVID-19及拉沙熱的治療中發(fā)揮作用。法匹拉韋作為嘌呤類似物，可抑制人類諾如病毒復(fù)制子。實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)鼠諾如病毒具有療效，在小鼠模型中通過(guò)抗病毒誘變降低病毒載量，并觀察到突變頻率增加及病毒 RNA 傳染性降低。然而，法匹拉韋可能在小鼠和患者體內(nèi)誘導(dǎo)誘變，用于慢性諾如病毒感染存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。

       利巴韋林（ribavirin）是廣譜抗病毒藥物，對(duì)DNA和RNA病毒均有效，臨床用于呼吸道合胞病毒、流感、拉沙熱、肝炎及麻疹治療。利巴韋林通過(guò)抑制RdRp發(fā)揮作用，對(duì)鼠諾如病毒抑制效果顯著，是當(dāng)前治療諾如病毒感染的主要藥物，尤其在原發(fā)性免疫缺陷患者的慢性感染中療效顯著。但其與硝唑尼特聯(lián)用效果存在爭(zhēng)議，部分臨床數(shù)據(jù)顯示療效欠佳

       2′-FdC（2′-fluoro-2′-deoxycytidine）是核苷類似物，其通過(guò)轉(zhuǎn)化為 2′-FdC-三磷酸（FdCTP）并入細(xì)胞 DNA/RNA，抑制病毒復(fù)制，對(duì)HCV、拉沙病毒及克里米亞-剛果出血熱病毒等均有效。研究發(fā)現(xiàn)，在RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞模型中，2′-FdC 能有效抑制鼠諾如病毒傳播。能夠顯著降低 RAW264.7 細(xì)胞中 MNV-1 的病毒RNA和NS1/2 蛋白表達(dá)。使用 100 μmol·L-1的 2′-FdC 處理后，諾如病毒滴度降低，其抑制 MNV-1 復(fù)制的 IC50 值為 20.92 μmol·L-1，RAW264.7 細(xì)胞中 2′-FdC 的CC50 值為 1.768 mmol·L-1。為進(jìn)一步驗(yàn)證 2′-FdC 的功效，研究人員測(cè)試了急性清除菌株 MNVCW3 和持續(xù)性菌株 MNVCR6，結(jié)果顯示 2′-FdC 同樣能抑制兩種病毒株的 RNA 復(fù)制及蛋白表達(dá)。

       2′-C-甲基胞苷（2′-C-methylcytidine, 2CMC）最初作為抗 HCV 藥物開(kāi)發(fā)，但其前藥 Valopicitabine 因胃腸道副作用終止臨床研究。然而，2CMC仍被報(bào)道為潛在抗諾如病毒藥物。研究表明，2CMC 可抑制鼠諾如病毒形成及RNA合成，并在小鼠模型中減少病毒脫落及傳播。在人類諾如病毒 BJAB 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，2CMC的EC50值為0.3 μmol·L-1。研究人員評(píng)估了2CMC衍生物，如2FCMC、N-羥基胞苷NHC的活性。在 RAW264.7 細(xì)胞中，2CMC 和2FCMC 的EC50 分別為 6.9 μmol·L-1和 12.7 μmol·L-1，而 NHC 和拉米夫定無(wú)顯著抑制。在 HG23 細(xì)胞中，2CMC、NHC和2FCMC的EC50分別為1.3 μmol·L-1、1.5 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1。目前研究聚焦于開(kāi)發(fā)更安全的 2CMC 衍生物。

       4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪核苷衍生物具有顯著抗諾如病毒活性。其通過(guò)修飾糖基和堿基獲得系列衍生物，其EC50為0.007~11 μmol·L-1，CC50 為0.01~23.7 μmol·L-1。盡管存在細(xì)胞毒性，但其雙重抗小鼠和人類諾如病毒活性為后續(xù)優(yōu)化提供了基礎(chǔ)。

       NCT（5-硝基胞苷三磷酸）最初作為抗脊髓灰質(zhì)炎病毒藥物被發(fā)現(xiàn)，其抑制 RdRp活性優(yōu)于利巴韋林。過(guò)X射線晶體學(xué)測(cè)定了諾如病毒聚合酶與NCT結(jié)合的高分辨率結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)顯示，RdRp被包裹在一個(gè)包含互補(bǔ)引物模板RNA和兩個(gè)金屬離子的三元復(fù)合物中。NCT分子占據(jù)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制導(dǎo)致RNA鏈終止，但其抑制諾瓦克病毒復(fù)制的潛力仍需更多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

       ②非核苷類抑制劑

       非核苷類抑制劑（non-nucleoside inhibitors, NNIs）通過(guò)與RdRp變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，終止復(fù)制所需的構(gòu)象變化。目前NNIs主要針對(duì)HCV或HIV開(kāi)發(fā)，尚無(wú)專門針對(duì)人類諾如病毒的上市藥物。

       蘇拉明（suramin）通過(guò)脂質(zhì)體遞送可抑制鼠諾如病毒復(fù)制，但其臨床應(yīng)用受限于藥代動(dòng)力學(xué)和毒性問(wèn)題。其衍生物PPNDS最初作為P2X1受體激動(dòng)劑，后證實(shí)對(duì)人諾如病毒和MNV RdRp具有強(qiáng)效抑制。PPNDS通過(guò)結(jié)合RdRp的NAF2位點(diǎn)廣泛抑制轉(zhuǎn)錄活性。在10 μmol·L-1濃度下，PPNDS對(duì)貓諾如病毒聚合酶的IC50達(dá)2.7 μmol·L-1。然而，蘇拉明及PPNDS因細(xì)胞通透性差和非特異性脫靶活性，需進(jìn)一步優(yōu)化以克服研發(fā)障礙。

       近年研究發(fā)現(xiàn)，HCV NNIs如JTK-109可通過(guò)結(jié)合Thumb I位點(diǎn)（Q414和R419）抑制杯狀病毒科，如諾如病毒屬、沙波病毒屬和拉戈病毒屬等6個(gè)RdRp的轉(zhuǎn)錄活性，其抑制諾如病毒RdRp的IC50為4.3~16.6 μmol·L-1。

       NIC02、NIC04、NIC10和NIC12化合物也是潛在的藥物支架。通過(guò)GTP摻入法動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，NIC02和NIC04可同時(shí)結(jié)合游離酶及酶-底物復(fù)合物。而NIC10和NIC12只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合，因此可能與底物結(jié)合位點(diǎn)不同的變構(gòu)口袋結(jié)合，所以NIC02和NIC04、NIC10和NIC12在諾如病毒RdRp中可能占據(jù)不同的結(jié)合位點(diǎn)。

       2、3C樣蛋白酶抑制劑

       諾如病毒3C樣蛋白酶（3CLpro）是一種半胱氨酸蛋白酶，其核心結(jié)構(gòu)與胰凝乳蛋白酶類似，由N端反平行β折疊和C端β桶結(jié)構(gòu)域組成?；钚晕稽c(diǎn)位于兩結(jié)構(gòu)域間裂口處，催化三聯(lián)體（Cys139、His30、Glu54）特異性識(shí)別P1 Gln殘基，負(fù)責(zé)病毒多蛋白裂解，生成結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白。因此，3CLpro是抗諾如病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)。

       蘆平曲韋（rupintrivir）最初針對(duì)人類鼻病毒3CLpro開(kāi)發(fā)，近期研究顯示其可抑制人類諾如病毒3CLpro，EC50為（0.3 ± 0.1）μmol·L-1，EC90為（1.5 ± 0.2）μmol·L-1。但A105V和I109V突變可降低病毒對(duì)蘆平曲韋的敏感性，耐藥機(jī)制尚不明確。

       GC376 等一系列 3CLpro 過(guò)渡態(tài)抑制劑。過(guò)渡態(tài)類似物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑在分子結(jié)構(gòu)上與底物相似，在酶促反應(yīng)中，抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)與酶的活性中心結(jié)合。過(guò)渡態(tài)抑制劑目前可分為兩類，一類是肽基化合物（如 GC376），研究人員利用諾如病毒蛋白酶在谷氨酰胺-甘氨酸肽位點(diǎn)裂解的特點(diǎn)，通過(guò)谷氨酰胺替代物發(fā)揮抑制作用?；诖私Y(jié)構(gòu)開(kāi)發(fā)的一系列變體均顯示出高水平抗病毒活性。另一類是大環(huán)化合物，作為肽基抑制劑的結(jié)構(gòu)修飾版本，旨在提高膜透性和口服生物利用度以增強(qiáng)臨床適用性。盡管其效果不及肽基抑制劑，但表現(xiàn)出對(duì) RNA 病毒的廣譜抗病毒活性。

       3、未知作用靶點(diǎn)藥物

       硝唑尼特（nitazoxanide, NTZ）最初作為抗寄生蟲(chóng)藥物開(kāi)發(fā)，后證實(shí)具有廣譜抗病毒活性，臨床用于流感及諾如病毒感染治療。硝唑尼特作為新型藥物的支架參與病毒復(fù)制的宿主調(diào)節(jié)過(guò)程。硝唑尼特生物利用度高且十分安全，具有豐富的上市后經(jīng)驗(yàn)，超過(guò)7500萬(wàn)成人和兒童服用過(guò)此藥物。而目前有多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)表明，硝唑尼特對(duì)于治療諾如病毒感染具有顯著療效。目前，其新型制劑正在進(jìn)行全球III期臨床試驗(yàn)，可抑制輪狀病毒、冠狀病毒、登革熱病毒等多種RNA/DNA病毒。

       參考資料

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       作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)食品的開(kāi)發(fā)與研究。