細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由不同種類(lèi)的細(xì)胞主動(dòng)釋放的納米級(jí)膜囊泡復(fù)合體，在細(xì)胞間通訊中承擔(dān)著信息和物質(zhì)傳遞的重要功能。EVs 的形成及分泌是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，根據(jù)國(guó)際 EVs學(xué)會(huì) 2018年版指導(dǎo)手冊(cè)，當(dāng)前研究中的囊泡類(lèi)型主要是小于200 nm 的小 EVs（small EVs，sEVs），包括外泌體和部分微囊泡。微囊泡的直徑在50～1000 nm，主要由細(xì)胞膜向外出芽而形成，此過(guò)程伴隨著生物活性脂質(zhì)、 mRNA 和蛋白等成分的轉(zhuǎn)運(yùn)。而外泌體是細(xì)胞內(nèi)體途徑起源，直徑在 30～150 nm 的囊泡。首先，細(xì)胞膜向內(nèi)出芽將蛋白、核酸和次級(jí)代謝產(chǎn)物等物質(zhì)包裹到膜囊泡中形成早期內(nèi)體，隨后，早期內(nèi)體進(jìn)一步成熟并轉(zhuǎn)化為晚期內(nèi)體，也稱(chēng)為多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）。MVBs包裹有腔內(nèi)小泡（intraluminal vesicles，ILVs），當(dāng)其與細(xì)胞膜融合時(shí)，ILVs 被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，稱(chēng)為外泌體。此外，植物外泌體的分泌還涉及液泡、胞外陽(yáng)性細(xì)胞器（exocyst positive organelles，EXPO）等途徑。與 MVBs 不同，EXPO 不屬于內(nèi)吞途徑，被認(rèn)為與自噬體的形成方式類(lèi)似，可通過(guò)與細(xì)胞膜融合從而釋放其內(nèi)部囊泡。當(dāng)前，植物來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（plant-derived extracellular vesicle，PDEV）是近年來(lái)植物學(xué)中備受關(guān)注的研究方向，新鮮植物組織來(lái)源的 EVs 的發(fā)生途徑主要包括 MVBs、EXPO、液泡3種，不同 EVs 的成分差異主要是由來(lái)源植物的基原或生長(zhǎng)代謝特性決定，而以上的不同形成機(jī)制造成了同一植物由不同途徑產(chǎn)生的囊泡在成分類(lèi)型或含量存在一定差異，進(jìn)而影響其生物學(xué)活性。       

       PDEV 的分離

       PDEV 的組成成分包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸（如miRNA、tRNA、mRNA）和次生代謝物等。PDEV的膜結(jié)構(gòu)由磷脂雙分子層構(gòu)成，具有高度特異的蛋白質(zhì)組成，如熱激蛋白、溶酶體相關(guān)蛋白等。此外，其中也含有大量具有抗菌和抗病毒活性的物質(zhì)，如植物防御性小分子和酶類(lèi)，表明它們?cè)谥参锟鼓嫘院托盘?hào)傳導(dǎo)中的重要作用。由于 PDEV的多樣性和復(fù)雜性，分離純化這些囊泡對(duì)于研究其功能具有重要價(jià)值。目前常用的 PDEV 分離方法有超速離心法、超濾法、聚合物沉淀法和尺寸排阻色譜法等，但大部分方法尚處于初步探索階段，因此開(kāi)發(fā)適合植物細(xì)胞的高效分離技術(shù)至關(guān)重要。

       ①超速離心法。

       超速離心法是當(dāng)前 PDEV 分離的常用方法之一，該方法依靠高速離心力將不同密度和大小的顆粒分離，是一種經(jīng)典的 EV分離方法，主要分為差速離心法和密度梯度離心法兩種。差速離心法是一種基于離心力逐步增加分離顆粒的技術(shù)。樣本的前處理需要額外的裁剪枝葉、壓榨并進(jìn)行研磨及浸泡處理，去除花青素等色素小分子。然后再通過(guò)低速離心（300~500 g）去除細(xì)胞和較大的細(xì)胞碎片，然后中速離心（2000~3000 g）去除更大的微粒。接著，高速離心（10000~20000 g）去除較大的胞器，如線(xiàn)粒體和葉綠體。最后，使用超高速離心（100000 g）來(lái)沉淀 PDEV。密度梯度離心法是通過(guò)在密度梯度介質(zhì)（如蔗糖或碘克沙醇）中進(jìn)行超高速離心，將 PDEV 與其他細(xì)胞碎片或亞細(xì)胞成分分離。由于 PDEV 的浮力密度不同于其他細(xì)胞器，密度梯度離心可以進(jìn)一步提高分離純度。這種方法尤其適合 PDEV 的純化，因?yàn)橹参锛?xì)胞質(zhì)復(fù)雜，存在大量的多糖和其他高分子雜質(zhì)，密度梯度離心法能夠有效區(qū)分這些雜質(zhì)和EV。

       超速離心法的主要優(yōu)點(diǎn)在于其相對(duì)成熟，能夠分離大量樣本，且實(shí)驗(yàn)設(shè)備易得。然而，它的缺點(diǎn)也較為明顯。首先，植物細(xì)胞中存在大量的多糖、纖維素等物質(zhì)，這些成分容易在離心過(guò)程中與 EV 混雜在一起，影響分離的純度。其次，超高速離心可能會(huì)導(dǎo)致 PDEV 的形態(tài)發(fā)生變化或結(jié)構(gòu)受損，影響后續(xù)功能研究。此外，離心法耗時(shí)較長(zhǎng)，尤其是在處理大體積樣本時(shí)，效率較低。

       ②超濾法。

       超濾法是另一種常用的分離方法，通過(guò)不同孔徑的濾膜將樣本中的不同大小的顆粒進(jìn)行分離。與超速離心法相比，超濾法的優(yōu)勢(shì)在于速度較快且操作步驟較為簡(jiǎn)單。尤其是在大體積樣本的處理過(guò)程中，超濾法能夠在短時(shí)間內(nèi)完成樣品的初步分離。此外，超濾法對(duì) PDEV的結(jié)構(gòu)影響較小，能夠較好地保持其形態(tài)和功能，適合下游的功能分析或活性研究。不過(guò)由于 PDEV 的尺寸和形態(tài)多樣，部分囊泡可能在濾膜的孔隙中丟失或被卡住，從而影響回收率。此外，植物細(xì)胞的多糖和其他高分子物質(zhì)可能導(dǎo)致濾膜堵塞，影響過(guò)濾效率。為了避免這種情況，通常結(jié)合其他技術(shù)（如離心或酶處理）來(lái)優(yōu)化超濾法的應(yīng)用。

       ③聚合物沉淀法

       現(xiàn)有的聚合物沉淀法通常采用分子量為6 000~20 000 Da 的聚乙二醇(PEG)。聚合物沉淀法雖然經(jīng)濟(jì)高效，但耗時(shí)仍較長(zhǎng)，且在提取的過(guò)程中，脂蛋白和聚合物之間可能會(huì)發(fā)生沉淀，導(dǎo)致 EV 的純度下降。

       ④免疫捕獲法。

       免疫捕獲法依賴(lài)于使用特定的抗體來(lái)識(shí)別相應(yīng)的EV膜蛋白質(zhì)標(biāo)志物，如哺乳動(dòng)物EV表面的CD9、CD63 等跨膜蛋白。不過(guò)，對(duì)于植物細(xì)胞來(lái)源的 EV 而言，仍然缺乏特定的標(biāo)志物，因此該方法的使用范圍較小，普適性不高。目前為止，僅在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了 EV標(biāo)志物，而其他植物的 EV標(biāo)志物仍在探索中。

       ⑤電場(chǎng)透析法。

       研究人員利用PDEV表面的天然負(fù)電荷，開(kāi)發(fā)了電場(chǎng)透析的方法來(lái)提取植物中的EV。有研究提出了一種基于電泳和透析的高效分離 PDEV 的方法，該方法耗時(shí)較短，且不需要特殊的設(shè)備。

       ⑥尺寸排阻色譜法。

       尺寸排阻色譜法是一種基于分子量大小進(jìn)行分離的方法。       

       PDEV的藥物裝載

       PDEVs的載藥方法可分為被動(dòng)加載和主動(dòng)加載兩種方式。被動(dòng)加載如共孵育是最簡(jiǎn)單的載藥方法，分離的 EVs 直接與藥物溶液孵育，藥物分子通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和親脂擴(kuò)散裝載至 PDEVs中。共孵育法已被用于多柔比星 (doxorubicin, DOX)、吲哚菁綠 (indocyanine green, ICG)、甲氨蝶呤 (methotrexate, MTX)、Apo B-siRNA 等藥物的 PDEVs 負(fù)載。共孵育法方便且成本低，但由于缺乏促進(jìn)藥物擴(kuò)散的外部動(dòng)力，共孵育法通常包封率較低。此外，由于EVs膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，親脂性藥物比親水性藥物更易通過(guò)孵育法裝載。

       主動(dòng)加載如電穿孔、超聲、共擠出、凍融循環(huán)等也是將藥物轉(zhuǎn)移到 EVs 中的有效方法。電穿孔法是利用瞬態(tài)弱電脈沖打開(kāi)脂質(zhì)雙分子層膜，形成可逆小孔。通過(guò)這些小孔，藥物分子得以進(jìn)入 EVs 的腔體。電擊時(shí)間僅為幾毫秒，不會(huì)破壞 PDEVs 的固有結(jié)構(gòu)。研究人員已通過(guò)電穿孔法成功將地塞米松磷酸鈉 (dexamethasone sodium phosphate, DexP)、DDHD1-siRNA 裝載至 PDEVs 中。

       超聲是通過(guò)超聲提供的能量和機(jī)械力暫時(shí)改變脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu)，藥物能夠穿透 EVs。超聲已被用于化學(xué)藥物（如 5-氟尿嘧啶）、基因藥物（如miR17）、蛋白質(zhì)藥物[如牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)、熱休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)] 等多種藥物的 PDEVs 負(fù)載。超聲處理對(duì) EVs 的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量沒(méi)有顯著影響，但超聲提供的外力可能會(huì)破壞 EVs 的結(jié)構(gòu)和完整性。

       共擠出技術(shù)是通過(guò)將 EVs 與藥物混合后共同通過(guò)狹窄的通道或孔隙進(jìn)行擠壓，產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械剪切力，從而使藥物分子進(jìn)入 EVs 的脂質(zhì)雙層或內(nèi)部。超聲和共擠出技術(shù)結(jié)合已被用于核酸藥物的裝載。共擠出法的優(yōu)勢(shì)在于能夠均勻、有效地實(shí)現(xiàn)藥物裝載，適用于多種類(lèi)型的藥物。但共擠出過(guò)程的機(jī)械剪切力可能損傷 EVs 的結(jié)構(gòu)，影響其生物活性。

       凍融循環(huán)也是一種常用的載藥方法。通過(guò)反復(fù)凍融，EVs 的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)輕微受損而形成孔隙，藥物分子得以擴(kuò)散進(jìn)入。有研究已經(jīng)利用該方法成功將人絨毛膜促性腺激素加載到子宮來(lái)源的外泌體中。此方法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì) EVs 結(jié)構(gòu)損傷較小、操作簡(jiǎn)便，但反復(fù)的凍融過(guò)程可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活、EVs 聚集及顆粒變大。相比于共孵育法，主動(dòng)加載法通常包封率較高。

       PDEVs 的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)使其能夠?qū)⒂H水藥物封裝在腔內(nèi)，并將疏水藥物裝載到脂質(zhì)雙分子層中。PDEVs 作為藥物載體在化學(xué)、基因、蛋白質(zhì)等多種藥物遞送中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。通過(guò) PDEVs 負(fù)載可提高藥物穩(wěn)定性、增強(qiáng)靶向性以及降低藥物毒副作用。不過(guò)，目前相關(guān)研究仍處于基礎(chǔ)研究階段，僅有極少數(shù)案例推進(jìn)至臨床試驗(yàn)。例如，臨床試驗(yàn) NCT01294072 探討了植物外泌體遞送姜黃素用于結(jié)腸炎和結(jié)腸癌治療的可能性。盡管試驗(yàn)尚未完成，但這一探索驗(yàn)證了 PDEVs 在改善藥物遞送效率方面的潛力，同時(shí)也反映出其臨床轉(zhuǎn)化的挑戰(zhàn)，包括標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、質(zhì)量控制等。      

       參考資料：

       [1]蘇勇匯,徐珊珊,王歡,等.藥用植物細(xì)胞外囊泡作為新型藥效物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中草藥,2023,54(12):4044-4052.

       [2]蘇翕索,劉定斌.細(xì)胞外囊泡分離研究進(jìn)展[J/OL].新興科學(xué)和技術(shù)趨勢(shì),1-18[2025-04-15].http://kns.cnki.net/kcms/detail/14.1408.N.20250326.0941.002.html.

       [3]劉怡君,王紅娟,張靖彬,等.植物細(xì)胞外囊泡作為藥物載體的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2025,60(03):721-730.      

       作者簡(jiǎn)介：@小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)食品的開(kāi)發(fā)與研究。