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褪黑素促進(jìn)骨再生作用機(jī)制的研究進(jìn)展（上）

上文中，我們介紹了褪黑素促進(jìn)骨再生作用的抗炎和抗氧化作用以及在成骨細(xì)胞分化和自噬的作用，本文繼續(xù)介紹褪黑素與成骨細(xì)胞凋亡和鐵死亡的關(guān)系以及對(duì)破骨細(xì)胞的作用機(jī)制和促進(jìn)血管生成的作用。

③褪黑素與成骨細(xì)胞凋亡

研究表明，褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響具有兩面性，且與褪黑素濃度密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用高糖培養(yǎng)成骨細(xì)胞48h后細(xì)胞的凋亡率為40.8%，凋亡蛋白cleaved caspase 3的表達(dá)升高，而加入褪黑素后細(xì)胞凋亡率為28.3%，cleaved caspase 3的表達(dá)降低。這與另外兩項(xiàng)研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，褪黑素干預(yù)后成骨細(xì)胞早期凋亡率、總死亡率以及Bax、caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯降低。研究表明，褪黑素可以緩解并改善成骨細(xì)胞的凋亡水平，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其與抑制成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)。褪黑素干預(yù)后可使枸櫞酸鐵銨和鋁作用成骨細(xì)胞造成ROS蓄積的結(jié)果得到緩解，使 ROS水平降低。研究表明褪黑素可使核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）途徑相關(guān)蛋白Nrf-2及HO-1表達(dá)進(jìn)一步的增加。Nrf-2是人抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的正向調(diào)節(jié)因子，Nrf-2通路的激活可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)大量抗氧化基因產(chǎn)物的表達(dá)水平，并降低氧化應(yīng)激水平，從而使凋亡水平降低，說(shuō)明褪黑素抑制成骨細(xì)胞的凋亡水平，可能與通過(guò)Nrf-2途徑抑制成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

另有研究表明使用高濃度褪黑素干預(yù)成骨細(xì)胞，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）、調(diào)節(jié)STIM1，導(dǎo)致Septin4、Septin7表達(dá)增加以及細(xì)胞膜鈣升高，成骨細(xì)胞過(guò)量表達(dá)Septin4，可使細(xì)胞骨架破壞、細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞數(shù)量減少。這可能與細(xì)胞膜鈣升高，通過(guò)ERK途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞都會(huì)使成骨細(xì)胞的凋亡明顯增加有關(guān)。

④褪黑素與成骨細(xì)胞鐵死亡

鐵死亡是一種鐵依賴性的細(xì)胞死亡方式，是由于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）抗氧化系統(tǒng)失調(diào)以及鐵超負(fù)荷所致，主要特征是細(xì)胞內(nèi)活性氧的堆積和線粒體形態(tài)、膜電位的改變。多項(xiàng)研究表明，褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞的鐵死亡具有抑制作用，且此作用與褪黑素改善成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激以及鐵自噬密切相關(guān)。首先，褪黑素通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1、Wnt以及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信號(hào)通路使成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平降低，從而抑制鐵死亡。研究表明褪黑素可以使高糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)生鐵死亡導(dǎo)致的GPX4和胱氨酸?谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC7A11）表達(dá)下調(diào)得到逆轉(zhuǎn)，從而抑制成骨細(xì)胞的鐵死亡。同時(shí)研究人員檢測(cè)核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）和血紅素加氧酶?1（HO-1）的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在褪黑素組中的表達(dá)水平明顯高于高糖組，而在使用Nrf2?SiRNA干擾后，褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞鐵死亡的改善作用則受到明顯抑制，這說(shuō)明其中Nrf2/HO-1通路起著重要作用。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鐵劑量依賴性下調(diào)Wnt靶基因以及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k 信號(hào)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，抑制其信號(hào)傳導(dǎo)，生成ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物（LPO）。在使用褪黑素后可逆轉(zhuǎn)鐵抑制的典型 Wnt及PI3K/AKT/GSK-3β /P70S6k 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少ROS和LPO的產(chǎn)生，改善氧化應(yīng)激，預(yù)防鐵死亡，恢復(fù)鐵死亡對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用。其次，褪黑素可以調(diào)節(jié)miR-550a-3p/ELAVL1軸，改善鐵自噬來(lái)抑制成骨細(xì)胞的鐵死亡。ELAV樣蛋白1 （ELAVL1） 是一種RNA結(jié)合蛋白，能夠介導(dǎo)鐵自噬，使鐵蛋白降解，氧化應(yīng)激水平升高，從而引起鐵死亡。 通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-550a-3p能夠靶向作用于ELAVL1，褪黑素干預(yù)高糖培養(yǎng)成骨細(xì)胞后miR-550a-3p表達(dá)上調(diào)，調(diào)控ELAVL1表達(dá)下調(diào)，減少鐵自噬的發(fā)生，從而使鐵死亡得到抑制。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，褪黑素顯著降低成骨細(xì)胞的鐵死亡水平是通過(guò)激活 Nrf2/HO-1通路、恢復(fù)Wnt及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信號(hào)通路傳導(dǎo)、上調(diào)miR-550a-3p，降低ELAVL1相關(guān)鐵自噬蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

3、褪黑素對(duì)破骨細(xì)胞的作用機(jī)制 

骨再生的控制不僅需要成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)，還需要破骨細(xì)胞的參與。破骨細(xì)胞源于造血干細(xì)胞，核因子κB 受體活化因子配體/核因子κB 受體活化因子(receptor actvator of nuclear factor-κBligand/receptor actvator of nuclear factor-κB，RANKL/RANK)通路的活化誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成。骨保護(hù)素是基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的誘餌受體，與 RANKL 結(jié)合并阻止其與 RANK 的相互作用。同時(shí)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的增殖和破骨細(xì)胞的存活。

褪黑素減少與骨吸收增加有關(guān)，提示褪黑素可能是一種內(nèi)源性破骨細(xì)胞抑制劑。血清中的低褪黑素水平與骨質(zhì)疏松癥患者的低骨密度也表現(xiàn)出相關(guān)性。通過(guò)抑制 MT2 受體依賴的核因子κB信號(hào)通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，并由 RANKL旁分泌下調(diào)破骨細(xì)胞的生成，表明褪黑素可能通過(guò)骨保護(hù)素/RANKL/RANK 軸影響成骨細(xì)胞系細(xì)胞和破骨細(xì)胞系細(xì)胞之間的相互作用。另有研究報(bào)道是褪黑素下調(diào)核因子κB 信號(hào)通路和活化 T 細(xì)胞核因子c-1 (NFATc1) 轉(zhuǎn)錄因子直接抑制破骨細(xì)胞的分化，而不涉及褪黑素受體。此外，褪黑素還上調(diào)骨細(xì)胞分泌降鈣素發(fā)揮對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用。在細(xì)胞水平上，褪黑素抑制 RAW 264.7 細(xì)胞在低濃度RANKL 和巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)下分化為破骨細(xì)胞。

4、褪黑素具有促進(jìn)血管生成的作用 

骨修復(fù)需要血液供應(yīng)和血運(yùn)重建來(lái)恢復(fù)受損區(qū)域，血管化是骨再生的前提和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。褪黑素促進(jìn)血管生成的機(jī)制是通過(guò)上調(diào)血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子水平促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成，即促進(jìn)骨生成-血管生成偶聯(lián)。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)褪黑素處理，在得到具有更高表達(dá)水平的成骨相關(guān)標(biāo)志物的同時(shí)，也得到更高表達(dá)水平的血管生成相關(guān)標(biāo)志物，如血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子、血管生成素2和血管生成素4。褪黑素納米復(fù)合支架的成功制備，實(shí)現(xiàn)了褪黑素的長(zhǎng)效緩釋和成骨能力的增強(qiáng)。將褪黑素包埋絲素電紡絲 (melatonin-encapsuled silk Fibronin electrospun，SF@MT) 納米纖維植入大鼠臨界尺寸的顱骨缺損中，通過(guò)激活 PI3K/Akt信號(hào)通路，可顯著促進(jìn)骨基質(zhì)沉積和新血管形成。負(fù)載褪黑素的納米纖維海綿支架 (Sca?old@MT) 的植入也顯著改善了大鼠股骨遠(yuǎn)端缺損的血管化骨再生。通過(guò)核因子紅系2 相關(guān)因子 2(nuclear factor-erythroid 2-Related Factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1) 信號(hào)通路，褪黑素納米復(fù)合支架可減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷以及直接刺激血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，從而逆轉(zhuǎn)糖尿病條件下骨生成-血管生成的解偶聯(lián)并促進(jìn)成骨。相關(guān)的骨組織工程的進(jìn)展進(jìn)一步證實(shí)褪黑素具有改善缺血組織血管生成的潛力，進(jìn)而加速骨修復(fù)。不過(guò)，也有研究指出，在腫瘤、年齡相關(guān)性眼病和低氧環(huán)境中，褪黑素抑制組織內(nèi)新血管生成，這與骨愈合過(guò)程中的觀察結(jié)果相矛盾。

參考資料

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[2]季明意,季欣意,徐俊峰.褪黑素促進(jìn)骨再生機(jī)制及在口腔種植中的應(yīng)用[J].中國(guó)組織工程研究,2025,29(18):3868-3876.

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作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營(yíng)養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。