泛素-蛋白酶體是“消化”細胞內蛋白質的重要途徑之一，它能調控多個重要的生命活動，如細胞增殖、分化、凋亡、DNA 修復等。近年來，人們逐漸認識到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的異常與多種不同疾病的發(fā)生密切相關，包括神經退行性疾病阿爾茲海默癥、亨廷頓病、癌癥、心血管和呼吸系統(tǒng)疾病等。在神經退行性疾病中，外源或者內源因素可以引發(fā)神經細胞內外蛋白質的錯誤折疊，從而影響泛素-蛋白酶體的降解功能而導致大量蛋白的異常堆積，甚至細胞死亡。而腫瘤的發(fā)生則與細胞過度增殖以及抗凋亡能力增強有關。泛素-蛋白酶體通過促進抑癌蛋白如P53的降解或者阻滯致癌蛋白降解而影響腫瘤細胞的存活。在近幾十年的研究中，泛素-蛋白酶體作為一個龐大的蛋白質機器，成為科學家們研發(fā)疾病潛在有效藥物的重要靶點。

       泛素-蛋白酶體途徑作用機制

       泛素-蛋白酶體途徑需要包括泛素（ubiquitin，Ub）、泛素激活酶 E1( ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素聚合酶(亦稱泛素載體蛋白)（ubiquitin-carrier protein，E2）、泛素連接酶（ubiquitin-ligating enzyme，E3）、26S蛋白酶體（26S proteasomes）和去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）等相關物質的參與。

       泛素-蛋白酶體途徑由底物蛋白質泛素化和底物通過蛋白酶體降解2個過程組成。泛素是一條由76個氨基酸組成的高度保守的多肽鏈。泛素通常以2種形式存在，一種是游離形式，另一種形式是與受體蛋白共價結合。泛素通過其C端與受體蛋白賴氨酸側鏈的ε-氨基或受體蛋白N端的α-氨基共價結合的過程稱為泛素化。泛素化是一個由泛素激活酶 E1，泛素聚合酶E2 和泛素連接酶E3等介導的多酶級聯反應。

       泛素激活酶E1在進化中很保守，是一種 ATP 依賴的酶，通過與泛素的 C 端形成高能硫酯鍵而激活泛素。與E1不同，細胞內存在多種 E2。E2 與活化的泛素結合形成E2-泛素復合體，E2協(xié)助特異性 E3將活化的泛素轉移到底物。泛素連接酶 E3是泛素化反應系統(tǒng)中數量最大、結構最多樣、調控機制最為復雜的成員，它可以直接與底物或通過輔助蛋白與底物相互作用，從而決定泛素介導底物蛋白質降解的選擇性。哺乳動物細胞內的E3 主要有三大類，即含HECT( homologous to E6-AP C-terminal) 結構域的E3、含環(huán)指結構( RING finger)的E3、含U-box 的E3。E3在泛素化過程中的作用主要包括3個階段：E3與E2的相互識別與作用、E3 與底物蛋白質的相互識別與作用、E3 催化泛素與底物蛋白質的連接及泛素與泛素之間的連接。最終，泛素通過其C端與受體蛋白賴氨酸側鏈的ε-氨基發(fā)生共價結合，而這些泛素分子上的48位、63 位賴氨酸又可以作為修飾位點，如此，底物蛋白上可以形成多泛素鏈。一般地，由48位賴氨酸殘基連接的4個或更多個泛素的底物蛋白質可以被 26S 蛋白酶體識別并將其降解，而由63位賴氨酸殘基連接的泛素鏈則不參與蛋白質的降解過程，其主要與細胞內信號轉導過程和 DNA 修復等相關。

       泛素在泛素化修飾的底物蛋白質被26S 蛋白酶體降解之前，可以被去泛素化酶( deubiquitinating enzyme，DUB) 水解脫離下來，從而避免其與底物蛋白一道被降解，解離下來的游離形式的泛素可以被循環(huán)使用。蛋白酶體是一種巨大的具有四級結構的復合蛋白酶(約2000 kD)，具有多種蛋白水解酶的活性，其蛋白降解功能主要依賴于泛素化過程。26S蛋白酶體由20S 核心復合物( core particle，CP) 和19S 調節(jié)復合物( regulatory particle，RP，也稱PA700) 組成。其中，20S是由4個同軸的、7個亞基組成的七聚體環(huán)疊而成的中空桶裝結構。兩側外環(huán)由 αl-α7 亞單位組成，2 個內環(huán)由 β1-β7 亞單位組成。3 個組成型表達的β亞基( β1、β2、β5) 具有蘇氨酸蛋白酶活性位點(分別為“半胱天冬酶-樣”活性位點、“胰蛋白酶-樣”活性位點、“胰凝乳蛋白酶-樣”活性位點)，且被封閉在降解腔的內側，從而有效阻止正常折疊的蛋白質進入降解腔。19S 調節(jié)復合物可以識別泛素化底物，去折疊底物并釋放游離形式的泛素，打開 α 環(huán)上的降解通道并將去折疊的底物送入降解腔。所以，泛素-蛋白酶體介導的迅速且不可逆的特異性蛋白質降解是一個高度復雜、受到嚴格調控的生命過程。

       泛素-蛋白酶體通路（來源文獻[1]）

       Ub：泛素；E1：泛素激活酶；E2：泛素載體蛋白；E3：泛素連接酶；DUB：去泛素化酶

       泛素-蛋白酶體與藥物研發(fā)

       目前已報道的多種人類疾病與蛋白酶體通路的異常有關。經批準的蛋白酶體抑制劑也已成功用于治療多發(fā)性骨髓瘤、套細胞淋巴瘤等癌癥，而正在開發(fā)的多個靶向泛素-蛋白酶體通路不同組分的藥物，如去泛素化酶抑制劑等臨床前測試藥物，泛素化酶調節(jié)劑、新的蛋白酶體抑制劑等臨床試驗藥物等也顯現出更值得期待的療效。

       1、蛋白酶體抑制劑

       目前已報道的有較好抗腫瘤效果的藥物有10余種，且用于臨床治療的藥物以蛋白酶體抑制劑居多。硼替佐米(Bortezomib)Bortezomib (PS-341)是首 個被 FDA 批準的以泛素-蛋白酶體通路為靶點的蛋白酶體抑制劑類藥物。Bortezomib 是一種硼酸二肽，它可以特異性地與20S蛋白酶體的β5亞基的蘇氨酸的活性部位結合，有效抑制胰凝乳蛋白酶活性。同時，它也可以與 β1 亞基的蘇氨酸的活性部位結合，抑制半胱天冬蛋白酶活性。Bortezomib是一類高選擇性的可逆抑制劑，也是一種被批準用于治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物。暴露于 Bortezomib 可以穩(wěn)定 p21，p27，p53蛋白以及促凋亡Bid和Bax 蛋白，阻斷細胞內 NF-κB 通路的激活，導致腫瘤細胞死亡。

       Carfizomib 作為第二代蛋白酶體抑制劑類藥物，于2012 年被 FDA 批準用于治療已經使用過Bortezomib 治療的多發(fā)性骨髓瘤患者。與Bortezomib不同，Carfizomib 屬于環(huán)氧酮類化合物，具有獨特的化學結構和選擇性，它的環(huán)氧酮部分與蘇氨酸的羥基和游離 α-氨基相互作用，以不可逆的方式形成嗎啉加合物。Carfizomib 與蛋白酶體其他 β 亞基如 β1、 β2 的結合能力要弱于 Bortezomib，從而降低了對胰蛋白酶、半胱天冬酶的活性抑制。 Ixazomib 是首 個被批準的口服硼酸酯類蛋白酶體抑制劑。數據顯示，Ixazomib 可以以“孤兒藥”或者聯合其他蛋白酶體抑制劑給藥的方式，用于治療多發(fā)性骨髓瘤、全身性輕鏈淀粉樣變等其他惡性腫瘤。此外，蛋白酶體的特殊亞基類抑制劑(β1i、β2i、β5i)，也可通過與亞基的結合，以可逆或者不可逆的方式占據蛋白質降解的結合位點，抑制降解、阻滯細胞周期，從而有效抑制腫瘤的復發(fā)。

       2、去泛素化酶抑制劑

       去泛素化酶抑制劑作用于半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。現已開發(fā)的與19S蛋白酶體相關的去泛素化酶主要有UCHL5 (or UCH37)、USP14、USP7和PSMD14 (POH1)等。P5091屬于噻吩類小分子抑制劑，它與P22077主要作用于USP7。研究發(fā)現，對Bortezomib治療產生耐藥性的多發(fā)性骨髓瘤患者中使用P5091，可誘導腫瘤細胞的死亡。WP-1130、b-AP15均可作用于多個去泛素化酶。多泛素化修飾蛋白的累積阻滯細胞周期，從而有效抑制結腸癌等腫瘤的發(fā)展。WP-1130與Bortezomib有協(xié)同的腫瘤治療作用，而b-AP15更多用于治療耐Bortezomib藥性的腫瘤。作為金屬蛋白酶家族成員之一的去泛素化酶PSMD14，其在細胞內水平負調控多發(fā)骨髓瘤細胞的增殖以及患者的生存率，由此，Cleave Biosciences公司設計合成了針對PSMD14的特異性抑制劑并已進入臨床試驗前期。

       3、泛素化酶調節(jié)劑

       E1是泛素化體系中的第一個酶。兩種E1 (Uba1和Uba6)調節(jié)了下游泛素化反應。因此，調控E1活性可調節(jié)下游某些與腫瘤相關蛋白的泛素化。目前，已有多種 E1 抑制劑被報道。例如，Uba1的抑制劑PYR-41 和PYZD-4409。但已進入臨床試驗的只有類泛素分子NEDD8 的E1活化酶抑制劑MLN4924。抑制E1會導致泛素化底物的累積，而 E1 較差的特異性和成藥性成為了發(fā)展 E1抑制劑的絆腳石。E2 抑制劑具有較強的選擇性，提供了在腫瘤治療方面更大的空間。如抑制劑CC0651 通過與CDC34 的結合而發(fā)生的構象改變阻滯了Ub 的級聯反應。E3的數量約有近700個，它能夠特異性識別蛋白質底物，從而使得它成為多種相關疾病的治療靶點。人們可以通過調控底物蛋白質的 E3 來調節(jié)目的蛋白，從而有針對性地提高療效。如MDM2是腫瘤抑癌基因p53的E3，阻斷MDM2和p53 的相互作用，可以穩(wěn)定 p53，從而阻滯腫瘤細胞周期，促進凋亡。Nutlin-3 是第一個以 MDM2 為靶點的 E3 抑制劑。Nutlin-3模擬并占據 p53 與 MDM2 的結合位點，從而避免 p53 被泛素標記而降解。作為另一種穩(wěn)定 p53的小分子藥物，RITA 通過與 p53 的 N 端結合從而抑制 p53 與 MDM2 之間的相互作用。被批準用于治療多發(fā)性骨髓瘤(MM)、套細胞淋巴瘤(MCL)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes)的藥物

       參考資料

       [1]陳禹杉,姜天霞,周魯明,馮仁田,邱小波.泛素-蛋白酶體通路與藥物研發(fā)[J].中國生化藥物雜志,2016,36(12):1-6.

       [2]劉揚.泛素-蛋白酶體與藥物應用[J].大學化學,2019,34(07):60-66.

       作者簡介：小泥沙，食品科技工作者，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事營養(yǎng)食品及功能性食品的開發(fā)與研究。